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大量的研究表明,心肌细胞凋亡是心肌肥厚向心力衰竭转化的重要机制,在急性缺血再灌注的病理损伤机制中也起着重要的作用。目前,对细胞凋亡的生化过程和信号传导途径已基本阐明,即死亡受体和线粒体凋亡途径,引发终极caspase级联反应致细胞凋亡,线粒体调控细胞凋亡机制已被广泛认同。心肌是能量代谢非常活跃的组织,线粒体的含量非常丰富。线粒体的主要功能是能量代谢,在心肌细胞生理功能中举足轻重,但近年来发现,线粒体与细胞凋亡关系密切,具有凋亡调节功能。线粒体代谢异常可表现为代谢途径改变或电子传递受损,它们与凋亡的关系尚不清楚。心肌肥大时,能量代谢途径发生了显著改变,脂肪酸氧化显著降低,而糖的利用明显增加,相应地调控脂肪酸氧化的酶基因表达下降,出现胚胎时代谢模式。这种能量底物优势转换的机制是多方面的,如慢性缺血缺氧、细胞内调节代谢途径的相关因子的浓度和酶的磷酸化程度的改变等,起关键作用可能是PPARalpha/PGC-1复合体的失活,PPARalpha/PGC-1复合体是调节脂肪酸氧化酶基因表达的主要因子。心肌肥大时,PPARalpha/PGC-1失活可能参与了能量底物转换的多个水平上的调控,包括这些脂肪酸氧化酶基因表达下降和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)途径产生的翻译后效应。但导致PPARalpha/ PGC-1复合体的失活的机制目前欠清楚。近年来研究发现,心肌细胞能量代谢功能失衡与心肌肥大、心力衰竭有关,并且认为是由于线粒体电子传递体系异常生成大量的氧自由基引起细胞凋亡。线粒体能量代谢依靠脂肪酸和糖氧化,二者相互调节,各种中间产物代谢完全。但在缺血缺氧等条件下,容易出现代谢中间环节受阻,有害产物堆积。线粒体代谢途径的改变可能与心肌细胞损伤有关。临床上,应用活化糖代谢或抑制脂肪酸代谢的药物,已收到了良好的心绞痛治疗效果。但是,目前还不清楚是脂肪酸代谢活化诱导细胞凋亡,还是糖代谢有氧氧化活化抑制细胞凋亡作用,也不清楚活化糖代谢有氧氧化或抑制脂肪酸代谢的药物能否抑制细胞凋亡,阐明这些问题,对于指导我们在防治或延缓心肌肥大向心力衰竭转化具有非常重要的意义。为了进一步探索心肌肥大时线粒体代谢途径由脂肪酸氧化向糖代谢转变以及肥大<WP=11>心肌缺血缺氧时脂肪酸氧化又突然活化这些代谢现象的发生机制,阐明线粒体代谢途径改变与细胞凋亡的关系。本课题进行了体外培养并诱导心肌细胞肥大;肥大心肌细胞缺氧复氧的培养;检测肥大心肌细胞缺氧复氧时细胞凋亡及能量代谢的变化;激活或抑制糖代谢时,PDH、CPT活性及糖氧化率和脂肪酸代谢率;激活或抑制脂肪酸代谢时,PDH、CPT活性及糖氧化率和脂肪酸代谢率。方法:用组织胰蛋白酶消化法分离、培养2-3d Wistar大鼠心肌细胞。无血清的培养基中加入0.1μmol/L AngⅡ+1μmol/L NE 培养12h,诱导心肌细胞肥大并通过测定细胞的表面积、蛋白质的含量及[3H]-Leu掺入量三种方法来鉴定。肥大心肌细胞在有血清的培养基中持续给95%N2和5%CO2 ,控制氧分压在5mmHg以下缺氧培养8h后,恢复给氧(20%O2,5%CO2)培养。在此基础上,分别在复氧后0,4,8,12h进行以下检测:① 用TUNEL法检测细胞的凋亡,取5个高倍视野(400倍),记数200个细胞中的阳性细胞数,计算出凋亡细胞率;② PDH活性测定:丙酮酸底物掺入心肌细胞代谢产生乙酰CoA,乙酰CoA与14C-草酰乙酸生成14C枸橼酸,用液体闪烁仪定量生成的乙酰CoA来反映PDH活性;③ CPT活性测定: 3H-肉碱底物、软脂酸与提取的心肌细胞线粒体温育,含14C产物用液体闪烁仪定量。④ 糖氧化测定:[U-14C]-D-葡萄糖与细胞温育1h,收集14CO2,液闪测定。⑤脂肪酸氧化测定:Na[1-14C]软脂酸与细胞温育1h,收集14CO2,液闪测定。干预实验:肥大的心肌细胞缺氧培养8h后,换无血清培养基有氧培养,同时加入干预试剂,分100 ,1000,10 000 μmol/L DCA、 0.1,1,10 μmol/L Antimycin A、0.1 ,1,10 μmol/L TMZ和20,40,80 μmol/L L-carnitine几组,各自分别在8h测定每组PDH和CPT活性、糖氧化率、脂肪酸代谢率; 复氧时加1000 μmol/L DCA、1 μmol/L Antimycin A、5 μmol/L TMZ和40μmol/L L-carnitine分别在0,4,8,12h测定各自PDH活性、CPT活性、糖氧化率、脂肪酸代谢率。结果:1. 心肌细胞肥大的诱导和鉴定:在加入Ang Ⅱ+NE培养12h培养后,心肌细胞蛋白质含量增加70.4%,心肌细胞表面积明显增加(49.7%);[3H]-Leu掺入量显著提高 (115.2%),心肌细胞发生了肥大。2. 缺氧复氧条件下心肌细胞凋亡率和线粒体代谢:肥大心肌细胞缺氧8h后凋亡率为10.4%左右,而非肥大心肌细胞凋亡率为8.3%,但随着有氧环境的恢复,肥大心肌细胞凋亡加速,12h后凋亡率达到22.8%以上,明显高于对照组(P<0.05)。表明缺氧复氧对肥大心肌细胞比正常心肌更容易引起凋亡。 <WP=12>3. 缺氧复氧条件下线粒体代谢:缺氧时,PDHa活性降低(P<0.05),PDHt变化不是很明显(P>0.05),PDHa/PDHt明显降低(P<0.05);心肌细胞糖氧化下降48%;CPT活性降低(P<0.05),脂肪酸氧化下降60%。复氧时,PDHa、PDHa/PDHt、CPT逐渐恢复到缺氧前的水平, 8h后糖氧化、脂肪酸氧化基本回到缺氧前的水平(P>0.05)。4. 干预实验:加入100 μmol/L—10 000 μmol/LDCA后, PDHa活性较对照