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乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,是世界上最常见的三种癌症之一,其发病率呈逐年上升趋势。现在常用来治疗乳腺癌的方法主要包括放、化疗及手术,以及靶向治疗和激素治疗,但这些方法往往不能得到令人满意的治疗效果,常伴随远处转移、转移后的一些并发疾病以及复发。因此,进一步了解乳腺癌发病机制,寻求新的乳腺癌治疗方案具有十分重要的临床意义。上皮细胞粘附分子(Epithelial cell adhesion molecules,EpCAM)是I型单次跨膜糖蛋白。正常的生理条件下,除鳞状上皮以外EpCAM在正常的上皮细胞中都有不同程度地表达,在病理情况下,EpCAM在所有的腺癌中,包括乳腺癌中高表达,其过表达与乳腺癌预后不良密切相关。越来越多的证据表明,EpCAM有助于乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭和转移。EpCAM过表达与乳腺癌患者生存期呈负相关,使其成为乳腺癌中一个潜在的诊断和治疗靶点。肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)是由肿瘤细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、免疫细胞等细胞以及其细胞外成分,例如细胞因子、生长因子和细胞外基质等组成,这些细胞因子在肿瘤微环境中通过各种手段加快肿瘤的进程,而大量研究结果发现肿瘤中血管生成的过程与肿瘤微环境密切相关。肿瘤在生长过程中,主要依靠充足的血管来为肿瘤细胞的增殖提供必要的营养和氧气,肿瘤细胞通过分泌肿瘤血管生成因子(Tumor angiogenesis factor,TAF)来启动血管生成并诱导肿瘤发生转移,其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在肿瘤的血管生成中起关键作用。VEGF是血管生成的主要介质,是人类癌变过程中血管生成和转移的主要调控因子。VEGF家族包括五个分泌蛋白(VEGF-A,B,C和D和胎盘生长因子(placental growth factor,PIGF)。而血管生成的过程高度依赖于VEGFA信号。VEGFA在绝大部分的恶性肿瘤中都被检测出表达,它在肿瘤血管生成过程中发挥着非常重要的作用。本课题前期工作已经证实下调EpCAM可以抑制乳腺癌细胞的生长和转移以及抑制乳腺癌细胞的粘附能力。本课题致力于研究EpCAM对乳腺癌细胞血管生成方面的影响及调控机制,探索新的乳腺癌治疗策略(乳腺癌靶点的新应用)。首先将EpCAM过表达质粒和EpCAM干扰序列瞬时转染到乳腺癌细胞(MCF-7,MDA-MB-231),通过CCK8细胞增殖检测方法,免疫荧光技术和免疫印迹技术,分析EpCAM对乳腺癌细胞增殖的影响。结果表明,EpCAM过表达使Ki67和PCNA蛋白表达升高,促进乳腺癌细胞增殖,而下调EpCAM使Ki67和PCNA蛋白表达降低,抑制乳腺癌细胞增殖。将乳腺癌细胞(MCF-7和MDA-MB-231)分别转染EpCAM过表达质粒和EpCAM干扰序列48 h,收集条件培养基,与HUVEC细胞共培养48 h。Western Blot结果显示,经过表达EpCAM条件培养基共培养后的HUVEC细胞中Ki67和VEGFA的表达明显高于下调的EpCAM条件培养基组。与下调EpCAM条件培养基组相比,HUVEC细胞经EpCAM过表达条件培养基共培养后JAK/STAT信号通路中p-JAK2和p-STAT3的表达水平明显升高。使用乳腺癌EpCAM过表达条件培养基处理HUVEC细胞48 h后进行成管实验,结果显示乳腺癌EpCAM过表达条件培养基增强了HUVEC细胞的管腔形成能力,同时我们利用离体大鼠主动脉环在乳腺癌条件培养基(对照组)、EpCAM过表达条件培养基和下调EpCAM条件培养基中孵育9days。结果发现乳腺癌EpCAM过表达条件培养基可以促进大鼠主动脉出芽。而使用EpCAM干扰序列处理乳腺癌细胞后的条件培养基可以显著抑制HUVEC细胞的增殖,降低微血管的形成和密度并抑制大鼠主动脉出芽的能力。综上所述,下调EpCAM通过JAK/STAT途径抑制乳腺癌中VEGFA的表达从而抑制乳腺癌血管生成。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)是一种广谱抗癌药,本课题前期工作发现下调EpCAM增强乳腺癌细胞对5-FU的化学敏感性,EpCAM的下调增强了5-FU的细胞毒作用,促进细胞凋亡,但下调EpCAM与5-FU联合对乳腺癌血管生成的作用仍未知。后续本实验采用5-FU作用于HUVEC,结果表明Ki67与VEGFA表达量明显降低,JAK/STAT信号通路中p-JAK2、p-STAT3表达量降低。将5-FU与乳腺癌下调EpCAM条件培养基联合作用于HUVEC,结果提示5-FU通过JAK/STAT通路进一步降低Ki67及VEGFA的表达,成管及出芽实验提示5-FU与乳腺癌下调EpCAM条件培养基联用增强抑制血管生成的能力。将5-FU与乳腺癌下调EpCAM条件培养基以及JAK2特异性抑制剂Ruxolitinib联合作用于HUVEC中48 h,结果提示JAK/STAT信号通路中p-JAK2、p-STAT3表达量下降,Ki67与VEGFA表达降低,因此乳腺癌中EpCAM的下调通过JAK/STAT信号通路降低了Ki67和VEGFA的表达,从而降低乳腺癌的血管生成能力。综上所述,我们的实验结果表明,EpCAM的下调通过JAK/STAT信号转导通路特异性靶向VEGFA在乳腺癌中发挥了强大的抗血管生成活性,下调EpCAM不仅能抑制乳腺癌细胞的增殖,还可以作为一种抗血管生成疗法联合5-FU等化疗药物在乳腺癌的治疗中发挥更大的作用。