膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤,占人体恶性肿瘤的第四位,严重威胁人类健康。尽管目前对于膀胱癌的发病机制及治疗研究已经取得了相当大的进步,但对于膀胱癌的病因、病理发病学、诊断和治疗等仍然有很多问题等待着人们去深入地探讨研究,其中,寻找敏感性高、特异性强、操作简单且副作用小的分子生物学肿瘤标志物一直是全球泌尿外科医师的一项重要课题。在现代临床医学中,对膀胱癌患者无论是手术治疗、全身放射放疗、化学药物治疗,还是膀胱腔内灌注化疗药物局部治疗,膀胱癌仍有较高的复发率,因此寻找一种预防和治疗膀胱癌的理想药物也迫在眉睫。Survivin是一种细胞凋亡强力抑制因子,与其他IAP(Inhibitor ofapoptosis familyof proteins,IAPs)家庭成员比较,Survivin具有独特的结构和表达,使其在肿瘤基因诊断治疗及耐药机制方面有较大价值。Survivin抑制细胞凋亡的作用是通过阻止caspase-3和caspase-7的激活来实现的。信号转导通路的异常改变是肿瘤细胞的重要生物学特性,其中PI3K/AKT信号转导通路在维持肿瘤细胞恶性生物学特性中起重要作用。肿瘤细胞在一系列内外因素的作用下,通过启动PI3K/AKT信号转导通路,诱导细胞的增殖、分化,避免细胞发生凋亡。AKT是细胞生存通路P13K/AKT的关键分子,其持续活化与肿瘤的发生发展密切相关,其与survivin的关系值得进一步探讨。本研究的目的是观察人体BTCC组织中的survivin表达特征和苦参碱对膀胱肿瘤T24细胞株的干预影响作用,检测T24细胞survivin因子及AKT和caspase-3的表达变化,并探讨苦参碱对膀胱癌的肿瘤抑制作用及其对survivin信号转导机制的影响。本实验分为两部分,第一部分选择62例经病理确诊的BTCC患者,采用免疫组化方法检测癌组织中survivin因子的表达情况,探寻survivin因子的表达与临床病理特征的关系。第二部分应用细胞培养技术,在膀胱癌T24细胞株中加入不同剂量的苦参碱共培养,观察细胞存活率、细胞凋亡的变化,分析苦参碱对膀胱癌T24细胞的影响作用,采用免疫组化染色和免疫印迹法检测不同分组的T24细胞株中survivin因子、AKT和caspase-3表达变化,探讨survivin在膀胱癌发病机制中的作用以及苦参碱对膀胱肿瘤细胞的影响。主要结果及结论如下:1、62例BTCC的survivin表达与患者性别、年龄无显著关联,即不同性别、年龄患者的survivin表达无显著性差异(P＞0.05)。2、survivin的表达在不同病理分级与浸润程度的BTCC组织中有明显不同,统计学意义显著(P＜0.01,P＜0.05)。3、survivin的表达在复发与无复发的BTCC组织中无统计学差异(P＞0.05),而在伴有淋巴结癌转移与无癌转移病例的比较分析中有显著性差异(P＜0.05),表明膀胱移行细胞癌的survivin表达与肿瘤复发无显著联系,而与BTCC淋巴结转移有直接关联。4、62例BTCC中43例survivin表达为阳性或强阳性,阳性率为69.4%。其中20例高分化BTCC中8例为survivin阳性表达,26例中分化BTCC中19例为survivin阳性表达,16例低分化BTCC均显survivin强阳性表达,表明survivin染色强度也随BTCC病理分级的增加显著增强。统计学分析表明,随BTCC病理分级的增加,survivin阳性发生率及染色强度显著增强。5、62例BTCC中40例FLKl为阳性表达,阳性率为64.5%。其中20例高分化BTCC中阳性7例,26例中分化BTCC中阳性17例,16例低分化BTCC中FLKl均为阳性表达。统计学分析表明,随BTCC病理分级的增加,FLKl阳性发生率及染色强度显著增强。6、62例BTCC中42例FLTl表达为阳性或强阳性,阳性率为67.7%。其中20例高分化BTCC中阳性8例,26例中分化BTCC中阳性18例,16例低分化BTCC FLYl均为阳性表达,统计分析表明,随BTCC病理分级的增加,FLYl阳性发生率及染色强度显著增强。7、在对62例BTCC的survivin表达与FLKl表达的关系分析中发现,survivin与FLKl共阳性表达例数为32例,占survivin阳性例数的74.4%,共阴性例数为11例,占survivin阴性例数的57.9%,统计结果表明,BTCC中,Survivin表达与FLK1表达具有相关性。在对62例BTCC的survivin表达与FLYl表达的关系分析中发现,survivin与FLTl共阳性例数为33例,占survivin阳性例数的76.7%,共阴性例数为10例,占survivin阴性例数的52.6%,统计结果表明,BTCC中,Survivin表达与FLT1表达具有相关性。提示Survivin可能是参与BTCC发生发展的重要因素之一,在BTCC组织的增殖及血管形成过程中,survivin和VEGF特异性受体FLK-1、FLY-1可能共同参与了这一作用。8、应用不同剂量的苦参碱与膀胱癌T24细胞共培养,结果发现,正常T24细胞为卵圆形、多角形或细长形,伸展较差,折光强,胞质透亮、细胞核轮廓清晰,圆形或椭圆形,核浆比例大。苦参碱组T24细胞随苦参碱浓度增高细胞出现皱缩、脱壁漂浮甚至破碎的现象,有明显的时间和浓度依赖关系。细胞活力检测和MTT检测结果发现,苦参碱组各浓度组12h检测结果与空白组比较即具有显著差异,24h和48h后,差异更显著,具有明显的时间和浓度依赖关系。膀胱癌T24细胞凋亡检测结果显示,苦参碱组平均凋亡细胞数呈上升趋势,随苦参碱浓度增加各组凋亡细胞数量显著增加。说明苦参碱对T24细胞具有显著的抑制作用,其中凋亡是T24细胞死亡的一种方式,证实了苦参碱对T24细胞的抗肿瘤效应。9、免疫组化法和免疫印迹(western blot)方法检测T24细胞survivin因子及AKT和caspase-3的表达变化,结果发现,survivin因子在膀胱癌T24细胞中普遍表达(胞浆和胞核均表达,以胞浆为主),空白组T24细胞survivin阳性光密度值12h、24h和48h无显著差异,苦参碱组随着加入不同浓度苦参碱处理后,survivin因子阳性表达逐渐降低,经统计学分析,组问比较差异显著。Western Blot检测显示了同样的结果,苦参碱能明显抑制survivin因子蛋白表达,培养12h后,survivin蛋白表达水平逐渐下降,具有显著的时间和浓度依赖关系。说明苦参碱可抑制T24细胞Survivin的表达,可抑制T24细胞AKT蛋白活性,通过提高T24细胞caspase-3蛋白活性导致了细胞凋亡的增加,同时证实survivin在T24细胞的存活及AKT信号通路中起关键性作用。综上所述,Surivivn在BTCC组织中有较高的表达率,Surivivn的表达与BTCC的病理分级、肿瘤浸润程度及淋巴结癌转移的发生显著相关,表明Surivivn可作为BTCC病理诊断的有效辅助指标。苦参碱可抑制膀胱癌T24细胞的存活,抑制T24细胞中Survivin的表达,显著影响T24细胞AKT蛋白活性及caspase-3蛋白活性,促进T24细胞凋亡的发生,提示苦参碱的积极抗肿瘤作用。