论文部分内容阅读
在众多的DNA损伤中,最致命的是DNA双链断裂（DSB）。X射线所导致的DNA双链断裂将启动细胞周期关卡,使细胞阻滞于G1和G2时相,同时对正处于S期的细胞,所有的DNA复制启动与延伸将停止。细胞受照后发生细胞周期阻滞的目的是进行损伤修复。细胞关卡是细胞受到损伤后自我保护的重要途径,使细胞获得充分的时间进行DNA修复。p53野生型的肿瘤细胞可以被阻滞在G1期进行损伤修复,p53突变细胞在DNA受损后只能被阻滞在G2期以修复损伤。由于G1期关卡必须经过p53蛋白才能发挥作用,因此对于p53功能缺失的肿瘤细胞,G2期关卡就成了受损细胞在有丝分裂前进行DNA修复的最重要的保护机制,G2期阻滞对这类细胞的存活至关重要。目的检测青蒿素对正常人皮肤成纤维细胞GM0639、p53野生型人宫颈癌细胞Siha、p53突变型人宫颈癌细胞HeLa的毒性作用,确定青蒿素增敏作用的最佳时间作用点和最佳剂量作用点。研究青蒿素对GM0639、Siha、HeLa细胞的辐射增敏作用,探讨其辐射增敏作用的机理。方法（1）以p53野生型人宫颈癌细胞Siha、p53突变型人宫颈癌细胞HeLa两株细胞为研究对象,以正常人皮肤成纤维细胞GM0639做对照。用MTT法检测经浓度为0、27.67、55.34、110.69、221.37、442.75nmol/ml的青蒿素与细胞作用24、48h的抑制率,分析细胞抑制率与药物浓度的关系;（2）MTT法检测55.34、110.69nmol/ml的青蒿素与三株细胞分别作用0、2、4、6h存活率的变化,检测青蒿素与三株细胞作用0、2、4、6h后4Gy X射线对细胞存活率的影响;（3）MTT法、克隆形成法检测青蒿素对GM、Siha、HeLa细胞的辐射增敏作用;（4）应用流式细胞术检测6Gy X射线照射后青蒿素对GM、Siha、HeLa细胞的细胞周期分布和细胞凋亡率的改变;（5）Western Blot法分析周期蛋白CyclinB1和周期蛋白调节因子Weel蛋白的表达变化。结果（1）GM、Siha、HeLa细胞的抑制率随着青蒿素浓度的增加而增大（p＜0.01）,随着与青蒿素作用时间的延长而增大（p＜0.01）。（2）55.34、110.69nmol/ml的青蒿素与GM、Siha、HeLa细胞作用0、2、4、6h后对细胞的存活率没有影响（p＞0.05）。55.34、110.69nmol/ml的青蒿素与GM、Siha细胞作用0、2、4、6h进行X射线照射后的存活率改变不明显（p＞0.05）,110.69nmol/ml的青蒿素与HeLa细胞作用0、2、4h进行X射线照射存活率变化不明显（p＞0.05）,作用6h进行X射线照射后存活率明显降低（p＜0.01）。（3）MTT法检测110.69nmol/ml的青蒿素与细胞作用6h对人正常细胞GM0639和人宫颈癌细胞Siha没有增敏作用（p＞0.05）,对人宫颈癌细胞HeLa的增敏作用显著（p＜0.01）,放射增敏比（SER）=1.17;克隆存活实验检测青蒿素对GM、Siha、HeLa细胞的辐射增敏性,结果发现青蒿素对GM、Siha细胞无辐射增敏性,对HeLa细胞有辐射增敏作用,SER=1.12。（4）青蒿素对GM、Siha细胞的细胞周期、细胞凋亡率没有明显影响（p＞0.05）,青蒿素联合X射线组能减弱X射线诱导的HeLa细胞G2期阻滞;与对照组和单照组相比,青蒿素联合X射线组可以增加HeLa细胞的细胞凋亡率（p＜0.01）。（5）青蒿素对GM、Siha细胞的周期蛋白CyclinB1、周期蛋白负性调节因子Wee1没有影响;青蒿素与HeLa细胞作用6h组和对照组CyclinB1、Wee1蛋白的表达没有发生变化,6Gy X射线照射后CyclinB1蛋白含量降低,Wee1蛋白含量上升,青蒿素联合X射线组与单照组相比CyclinB1蛋白含量明显上升而Wee1蛋白含量明显下降。结论（1）青蒿素对GM、Siha、HeLa的抑制率在研究的范围内呈浓度依赖性和时间依赖性。（2）青蒿素对HeLa细胞有放射增敏作用,而对GM、Siha细胞没有放射增敏作用。青蒿素对HeLa细胞的辐射增敏作用与其降低HeLa细胞的亚致死性损伤修复的能力有关。（3）青蒿素可以减弱X射线诱导的G2期阻滞,使更多带有辐射损伤的细胞进入有丝分裂期,受损伤的细胞得不到足够的时间进行功能修复发生凋亡。（4）X射线降低HeLa细胞CyclinB1蛋白的水平、增加Wee1蛋白的含量,青蒿素联合X射线组能逆转这种变化,表明青蒿素是通过改变HeLa细胞周期调控的信号因子来发挥辐射增敏作用的。