论文部分内容阅读
目的1.探讨谷氨酸(Glu)兴奋毒性损伤后,羟基红花黄色素A(HSYA)对器官型脑片海马齿状回(HDG)神经发生的影响。2.研究Glu兴奋毒性损伤后,HSYA对器官型海马脑片神经细胞死亡的影响,以及保护线粒体功能的机制。3.探讨Glu兴奋毒性损伤后,HSYA对大鼠皮层神经细胞凋亡的影响,以及对p38MAPK途径诱导凋亡的作用。方法1.制备出生后6天SD乳鼠器官型海马脑片,按随机数字表法分为4组(每组6张脑片)：(1)生理盐水对照组(3.5mM Glu+1ml生理盐水干预,CG)；(2)空白对照组(正常培养,不造模+不干预,Nor)；(3)大剂量HSYA组(3.5mMGlu+1ml0.072mg/ml HSYA干预,HG1)；(4)小剂量HSYA组(3.5mM Glu+1ml0.036mg/ml HSYA干预,HG2)。建立Glu损伤模型,造模前及造模后1d、3d和6d通过倒置显微镜及免疫荧光染色观察脑片生长情况,按常规方法分别进行BrdU与Nestin免疫荧光双标染色。计数HDG中神经干细胞(Neural stem cells, NSCs)并进行重复测量的方差分析,每个时间点各组之间的比较采用单因素方差分析,各组内不同时间之间的比较采用重复测量的方差分析,主效应不同水平间的多重比较采用LSD法,P<0.05为差异有统计学意义。2.制备出生后6天SD乳鼠器官型海马脑片,按随机数字表法分为5组(每组5张脑片)：(1)正常对照组(正常培养基培养,Nor)；(2)大剂量HSYA干预组(3.5mM Glu+lml0.072mg/ml HSYA干预,HGl)；(3)小剂量HSYA干预组(3.5mM Glu+lml0.036mg/ml HSYA干预,HG2)；(4)生理盐水对照组(3.5mMGlu+1ml生理盐水干预,CG)；(5)大剂量HSYA对照组(1ml0.072mg/ml HSYA干预,Only)。建立Glu损伤模型,加入含有不同浓度HSYA的培养基(0.072mg/ml,0.036mg/ml)(?)化72小时,加入HSYA前、24和48小时后分别测量PI摄取量。蛋白免疫印迹分析5-LO,caspase-3, SOD2, P-Akt蛋白表达水平。各组之间PI荧光值,5-LO, caspase-3, SOD2, P-Akt蛋白表达量的比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),方差齐时组内两两多重比较采用LSD法,方差不齐时组内两两多重比较采用Tamhane’s T2法,P<0.05为差异有统计学意义。3.用胚胎18天(E18)SD大鼠制备前额叶皮层神经元的原代培养,在体外培养10至14天后建立Glu损伤模型。按随机数字表法将神经细胞分为5组(每组5孔)：(1)正常对照组(正常培养基培养,Nor)；(2)大剂量HSYA干预组(3.5mM Glu+0.072mg/ml HSYA干预,HG1)；(3)小剂量HSYA干预组(3.5mM Glu+0.036mg/ml HSYA干预,HG2)；(4)生理盐水对照组(3.5mM Glu+生理盐水干预,CG)；(5)大剂量HSYA对照组(0.072mg/ml HSYA干预,Only).MTT法,Hoechst33258/PI双染,流式细胞术(Annexin V-FITC/PI双染法)检测神经细胞死亡和凋亡。RT-PCR法检测caspase-3、ATF2、p38MAPK、MAPKKK的表达。不同组别之间神经细胞凋亡的比较、RT-PCR相对密度的比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),组内两两多重比较采用LSD法,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.低倍镜下(40×)正常脑片呈褐色,颜色均匀,透光性良好,可清晰分辨皮层、海马(CA1-4及DG区)、脑室、皮层下核团,白质纤维束等结构。高倍镜下(200×)可见胞质和胞核。Glu损伤前后不同时间点之间NSCs(BrdU+, Nestin+)的差异有统计学意义(F=228.075,P<0.001),HG1, HG2, CG及Nor均如此,F值分别为31.537,181.762,248.345和52.444,均.P<0.001。各组之间神经干细胞数的差异有统计学意义(F=947.077,P<0.001)；从各时间点看,除Glu损伤前,各时间点神经干细胞数均存在下列关系：Nor>HG1>HG2>CG(均P<0.001)。Glu损伤前后与不同组别之间存在交互效应(F＝123.639,P<0.001)。2.3.5mM Glu损伤后24和48小时主要导致海马DG区递增性细胞死亡。Glu损伤24h后各组之间PI荧光值的差异有统计学意义(F=11.305,P=0.002)；HG1<CG, HG1<HG2,差异有统计学意义(均P<0.05)。Glu损伤48h后各组之间PI荧光值的差异有统计学意义(F=11.731, P=0.002); HG1<CG, HG2<CG, HG1<HG2,差异有统计学意义(均P<0.05)。各组之间5-LO的差异有统计学意义(F=46.702,P=0.000)；Nor<HG2, Nor<CG, HG1<CG, HG2<CG,差异有统计学意义(均P<0.05)。各组之间caspase-3的差异有统计学意义(F=19.419,P=0.000); Nor<HG2, Nor<CG, HG1<CG,差异有统计学意义(均P<0.05)。各组之间SOD2的差异有统计学意义(F=15.483,P=0.000)；Nor>HG1,Nor>HG2, Nor>CG, HG1>CG, HG2>CG,差异有统计学意义(均P<0.05)。各组之间P-Akt的差异有统计学意义(F=23.299,P=0.000)；Nor>HG2, Nor>CG, HG1>CG, HG1>HG2,差异有统计学意义(均P<0.05)。3.MTT法测得各组之间细胞存活率的差异有统计学意义(F=17.063,P=0.000); Nor<HG1, Nor<HG2, Nor<CG, HG1<CG, HG2<CG,差异有统计学意义(均P<0.05)。Hoechst33258和PI双染,HG1、HG2、CG三组呈弱蓝色荧光细胞依次减少,呈强蓝色及弱红色双染细胞依次增多,呈强红色及弱蓝色的坏死细胞也依次增多。各组之间凋亡细胞率的差异有统计学意义(F=29.965, P=0.000); Nor<HG1, Nor<HG2, Nor<CG, HG1<CG, HG2<CG,差异有统计学意义(均P<0.05)。流式细胞分析：各组之间早期凋亡细胞率的差异有统计学意义(F=55.089,P=0.000);Nor<HG1,Nor<HG2,Nor<CG,HG1<CG,HG2<CG, HG1<HG2,差异有统计学意义(均P<0.05)。各组之间晚期凋亡细胞率的差异有统计学意义(F=13.519,P=0.000)；Nor<HG2, Nor<CG, HG1<CG, HG1<HG2,差异有统计学意义(均P<0.05)。各组之间坏死率的差异有统计学意义(F=26.957, P=0.000); Nor<HG1, Nor<HG2, Nor<CG, HG1<CG, HG2<CG,差异有统计学意义(均P<0.05)。RT-PCR结果：各组之间caspase-3的差异有统计学意义(F=39.237, P=0.000); Nor<HG2, Nor<CG, HG1<CG, HG2<CG,差异有统计学意义(均P<0.05)。各组之间ATF2的差异有统计学意义(F=53.137,P=0.000);Nor<HG2, Nor<CG, HG1<CG, HG2<CG,差异有统计学意义(均P<0.05)。各组之间P38MAPK的差异有统计学意义(F=23.645,P=0.000);Nor<HG2, Nor<CG, HG1<CG, HG2<CG, HG1<HG2,差异有统计学意义(均P<0.05)。各组之间MAPKKK的差异有统计学意义(F=10.174,P=0.001);Nor<HG2, Nor<CG, HG1<CG, HG1<HG2,差异有统计学意义(均P<0.05)。结论1.0.072mg/ml HSYA减轻Glu兴奋毒性对NSCs的损伤,促进NSCs再生。2.0.072mg/ml HSYA减少Glu造成的神经元死亡,这种保护作用24h出现,可持续至48h。Glu兴奋性损伤导致神经元线粒体功能障碍,0.072mg/ml HSYA通过降低5-LO和caspase-3,升高SOD2和磷酸化Akt的蛋白表达,保护线粒体功能,减少神经细胞死亡。3. HSYA主要是通过抑制Glu诱导的细胞凋亡来保护神经细胞0.072mg/ml HSYA作用于p38MAPK通路的上游激活物MAPKKK,核心蛋白激酶p38MAPK,下游转录因子ATF2,以及最后的效应蛋白caspase-3多个位点,下调其基因表达,抑制神经元的凋亡。