论文部分内容阅读
研究背景:肺上皮细胞再上皮化对ARDS的修复过程非常重要。磷酸化作用影响着转录因子的泛素化、稳定性及活性,从而调节了多种细胞功能。转录因子E2F1调节Peg10基因的表达,促进细胞的增殖。但是,E2F1的稳定性对Peg10表达的作用及磷酸化对E2F1稳定性的分子调节机制尚不清楚。USP11是一种DUBs,可以逆转多聚泛素化的蛋白底物,对于调节蛋白功能及信号转导具有重要意义。有研究指出去泛素化酶UCH37和POH1介导E2F1的去泛素化,增加E2F1的稳定性。本研究主要针对USP11对E2F1蛋白去泛素化及蛋白稳定性的影响,探讨USP11在肺损伤后修复中的作用机制。实验方法:[1]通过转染Usp11 Sh RNA质粒下调USP11后,采用Western Blot法和q RT-PCR方法测定PEG10的蛋白和m RNA水平。[2]通过转染E2f1 si RNA质粒下调E2F1或者转染Usp11 Sh RNA质粒下调USP11后通过转染HA-E2f1质粒过表达E2F1,采用Western Blot法和q RT-PCR方法测定PEG10蛋白和m RNA水平;通过转染Usp11 Sh RNA质粒下调USP11后采用Western Blot法和q RT-PCR方法测定E2F1、E2F2及、E2F4蛋白水平和E2f1 m RNA水平;使用USP11小分子抑制剂MX处理细胞后,采用Western Blot法和q RT-PCR方法分别测定PEG10及E2F1蛋白和m RNA水平。[3]下调USP11和通过过表达Usp11C318S抑制USP11或者过表达USP11后,使用免疫沉淀法和Western Blot测定E2F1的泛素化水平;运用免疫共沉淀法测定USP11和E2F1存在相互作用;应用蛋白质合成抑制剂放线菌酮(CHX)处理细胞时,与对照组细胞相比,通过Western Blot测定E2F1的蛋白水平。[4]过表达USP11-V5和USP11ΔNLS-V5时,或者过表达USP11-V5和HA-E2F1时,通过免疫荧光技术测定USP11在亚细胞内的位置及USP11和E2F1在细胞内的共定位;过表达USP11-V5或者USP11ΔNLS-V5,通过免疫沉淀和Western Blot法测定E2F1泛素化水平,通过Western Blot测定E2F1蛋白的水平。[5]过表达活跃形式的GSK3β(GSK3βS9A),通过免疫沉淀和Western Blot法测定E2F1磷酸化水平及泛素化水平;用GSK3β的抑制剂TWS119处理细胞,通过Western Blot法测定E2F1蛋白的水平,通过免疫沉淀和Western Blot法测定E2F1泛素化水平。[6]用TWS119处理细胞或者过表达GSK3β,运用免疫共沉淀测定E2F1和USP11的相互作用;过表达GSK3β或者HA-E2F1S403A突变体,运用免疫沉淀法和Western Blot法测定HA的磷酸化水平、泛素化水平和USP11和HA的相互作用;过表达E2F1或者HA-E2F1S403D,运用免疫沉淀法和Western Blot法测定USP11与HA的相互作用及HA的泛素化水平。[7]转染Usp11 Sh RNA下调USP11或者过表达Usp11C318S抑制USP11后,通过电子细胞基质阻抗传感系统(ECIS)测定细胞增殖和迁移的能力;应用不同剂量的MX或者TWS119处理细胞,通过ECIS测定细胞损伤修复的能力;在转染Peg10 si RNA质粒敲除PEG10细胞上过表达USP11,通过ECIS测定细胞损伤修复的能力;下调USP11的基础上过表达E2F1,通过细胞划痕实验测定细胞迁移的能力。实验结果:[1]USP11在m RNA和蛋白水平上上调PEG10的表达。[2]USP11通过增加转录因子E2F1的水平上调Peg10的表达。[3]USP11去泛素化和稳定E2F1。[4]核USP11对调节E2F1至关重要。[5]GSK3β介导E2F1的磷酸化促进E2F1的去泛素化和稳定性。[6]GSK3β促进E2F1和USP11相结合。[7]USP11通过稳定E2F1促进细胞增殖和迁移。结论:1)转录因子E2F1调节PEG10的表达,促进肺上皮细胞增殖和迁移。2)下调USP11减少E2F1的去泛素化,降低E2F1的稳定性,因此减少PEG10的m RNA水平。3)GSK3β磷酸化E2F1促进E2F1与去泛素化酶USP11的相互作用,防止了细胞核内E2F1的降解。4)生理上USP11的缺失抑制了肺泡上皮细胞的增殖和损伤后修复,但这个作用可以被过表达E2F1和PEG10所逆转。