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猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病。不同年龄和不同品种的猪均易感,但对哺乳仔猪危害最为严重患病仔猪死亡率很高。本研究以纯化的PEDV全病毒为免疫原,经4次免疫6周龄BALB/c小鼠,在最后一次免疫后3天取其脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞进行融合。采用间接ELISA和有限稀释法经培养、筛选和亚克隆,制备了两株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为5F4和5B3。2株杂交瘤细胞染色体数目在75～120之间。Westem-blot和间接免疫荧光鉴定结果显示2株单抗均能特异性地与PEDV发生反应。间接ELISA表明2株单抗不与TGEV、PRV等病毒反应,说明获得的单抗与PEDV具有一定的特异性。通过对单抗识别PEDV结构蛋白位点的鉴定结果表明,2株单抗均识别PEDV蛋白上相同的抗原位点,且是针对PEDV的S蛋白。抗PEDV单克隆抗体的制备为以单抗为主要检测试剂进行PED病原学免疫学检测提供了重要的物质基础。将PEDV细胞培养物,进行病毒纯化和浓缩,以全病毒免疫白兔制备了兔抗PEDV的高免血清,ELISA效价为1x10-5。利用多抗作为捕获抗体,单抗作为检测抗体,猪粪便样品为检测抗原,建立了双抗体夹心ELISA。通过试验确定了兔抗PEDV的适宜的稀释度为1:800,该方法的阳性判定标准为S/N>2,同时OD490nm≥0.37,该方法最低检测限为5×103.67 TCID50/ml。用建立的方法检测含有PEDV、TGEV和PRV的粪便,检测结果显示PEDV检测为阳性,其余为阴性,表明本方法有较好的特异性。建立的ELISA方法对来自不同猪场的48份猪粪便样品进行检测,本实验建立的ELISA方法共检出阳性样品19份,阳性率为39.6%(19/48),而RT-PCR方法检测出阳性样品21份,阳性率为43.8%(21/48)。两方法相比较结果显示,RT-PCR方法检测为阴性的样品,同时本实验所建立的双抗体夹心ELISA方法,检测也为阴性,而RT-PCR方法检测为阳性的样品中有两份样品本方法检测为阴性,据此得出结论,阴性样品的符合率为100%(27/27),阳性样品的符合率为90.5%(19/21),表明建立的双抗体夹心ELISA方法具有较高的特异性和准确性,可用于粪便中PEDV的快速检测。该方法的建立不仅为猪流行性腹泻的鉴别诊断及流行病学调查提供了一种简便的方法,也为探索更准确、更直观、更简便的检测方法提供了试验依据。