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研究背景急性脊髓损伤(spinal card injury，SCI)后其病理发展由两种损伤机制主导，即原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤被动地发生在损伤后短时间内，产生的神经损伤是不可逆转的；继发性损伤主要表现为兴奋性死亡和凋亡二种形式，在创伤后几小时、几天或更长时间发生，是由多种因素所致，是一个可逆的且可控制的复杂的自我破坏级联反应过程，是加重神经功能障碍的主要原因，其具体机制仍末明晰。目前已发现在脑、脊髓缺血性和机械性损伤模型中，广泛存在DNA损伤，表现为神经细胞凋亡、转录水平修复、相关基因表达等。而如何抑制促神经细胞凋亡的基因、生物因子，以及如何增加抗神经细胞凋亡的基因、生物因子，并及早识别细胞早期凋亡的特征，挽救濒临死亡的神经元己成为今后研究重点之一。细胞凋亡的相关基因可分为凋亡促进基因和凋亡抑制基因。目前研究认为bcl-2可以抑制由多种细胞毒素所引起的细胞死亡，bcl-2的过度表达能增强所观察细胞对大多数细胞毒素的抵抗性。这一发现使人们认识到调亡的各种信号转导途径有一个共同的通路成交汇点，而该通路成交汇点可能受bcl-2调节。而bax蛋白属于bcl-2家族，基本生物功能是促进细胞的凋亡。caspase-3是凋亡促进基因，是凋亡过程中最重要的蛋白酶，是多种凋亡途径的共同下游效应部分，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，它与bcl-2在凋亡调控中的相互关系比较复杂。二甲胺四环素(Minocycline)属第二代半合成的四环素类药物，脂溶性较高，且可透过血脑屏障，在四环素类中抗菌作用最强，具有高效和长效性质。二甲胺四环素不仅有强大的抗菌作用，并且有明显的抗炎效果。近年来有研究表明其对脑组织缺血有明显的神经保护功能。二甲胺四环素对中枢神经系统损伤的神经保护作用确切机制尚不十分清楚，有多种可能，其中一种可能是二甲胺四环素的抗细胞凋亡作用。最近研究发现，二甲胺四环素可以明显降低caspase-1和caspase-3 mRNA的表达，提高转基因Huntington’s疾病动物模型的生存率。有研究通过RT-PCR分析发现用二甲胺四环素治疗后，能提高大鼠IL-10的mRNA的表达，降低TNF-α表达，减少细胞死亡，促进下肢功能的康复。目前国内关于二甲胺四环素对SCI的神经保护作用的研究报道甚少。目的1．探讨大鼠SCI后损伤区脊髓组织中bcl-2、bax和caspase-3基因的表达情况、变化规律及与细胞凋亡的关系。2．探讨二甲胺四环素对大鼠SCI后损伤区脊髓组织中bcl-2、bax和caspase-3的表达的影响。3．探讨二甲胺四环素对大鼠SCI后神经功能恢复的影响。方法1．利用改良Allen’s打击法制作大鼠脊髓不完全损伤模型。2．采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法和Western印记分析(Westernblot)法检测SCI后不同时间点损伤区脊髓组织中bcl-2、bax和caspase-3 mRNA和蛋白含量的表达。用TUNEL方法检测SCI后不同时间点损伤区脊髓组织中细胞凋亡情况。3．对SCI大鼠，分别给予二甲胺四环素(MIN)或生理盐水(SAL)治疗，用RT-PCR法和免疫组织化学染色(SABC)法检测伤后不同时间点损伤区脊髓组织中bcl-2、bax和caspase-3 mRNA和蛋白含量的表达。4．对SCI大鼠，分别给予二甲胺四环素、生理盐水和甲基强的松龙(Methylprednisolone，MP)治疗，在伤后不同时间点(1～28d)用斜板试验、BBB评分对大鼠后肢运动功能观测，并用免疫荧光法检测伤后4周脊髓组织损伤尺寸大小。结果1．bcl-2、bax和caspase-3 mRNA无损伤脊髓组织中稍有表达。SCI后8h，bcl-2 mRNA表达明显上调(P＜0.05)，3d达到高峰，与对照组比差异非常显著(P＜0.01)，7d后开始下降，21d接近对照组水平；bax mRNA 4h后即有明显表达(P＜0.05)，1～3d达到高峰，7d仍有持续较高表达，持续至伤后14d，与对照组比差异非常显著(P＜0.01)，伤后21d起表达减弱，并接近对照组水平；caspase-3 mRNA SCI后8h内表达升高(P＜0.05)，3～7d表达达到高峰(与对照组比差异非常显著，P＜0.01)，仍较高表达持续至伤后14d(与对照组比差异显著P＜0.01)，伤后21d表达接近对照组水平。2．bcl—2、bax和caspase—3蛋白表达在无损伤脊髓组织中低。SCI后8h，bcl-2蛋白表达明显上调，3d达到高峰，与对照组比差异非常显著(P＜0.01)，7d后开始下降，21d接近对照组水平；bax蛋白脊髓损伤4h后即有明显表达，3d达到高峰，7d仍有持续较高表达，持续至伤后14d，与对照组比差异非常显著(P＜0.01)，伤后21d起表达减弱，并接近对照组水平；caspase—3酶原蛋白SCI后8h内表达升高，3～7d表达达到高峰(与对照组比差异非常显著，P＜0.01)，仍较高表达持续至伤后14d，照组比差异显著(P＜0.05)；caspase-3 17kD亚单位在对照组无表达，SCI后4h出现表达，3～7d表达达到高峰(与对照组比差异非常显著，P＜0.01)，伤后21d仍有表达。3．无损伤对照组有微量的凋亡细胞。损伤组伤后4h损伤部位开始少量出现阳性表达，伤后8h数量增加(P＜0.05)，此后阳性细胞逐渐增多，3～7d达高峰(P＜0.01)，14d仍有表达，伤后3周阳性表达与对照组无显著差异(P＞0.05)4．二甲胺四环素治疗组，脊髓损伤后8h，bcl-2 mRNA表达高于SAL对照组(P＜0.05)，1d，3d，7d各时间点bcl-2 mRNA表达明显增加，与SAL对照组比差异非常显著(P＜0.01)；伤后8h，1d，3d，7d，21d各时相点二甲胺四环素治疗组bax mRNA表达与SAL对照组比无显著性差异(P＞0.05)；伤后8h，1d，3d，7d各观察时间点，二甲胺四环素治疗组caspase-3 mRNA表达明显低于SAL对照组，与SAL对照组比差异非常显著(P＜0.01)，SCI后21d，二甲胺四环素治疗组caspase-3 mRNA亦低于对照组(P＜0.05)。5二甲胺四环素治疗组，脊髓损伤后8h，1d，3d，7d，21d各观察点bcl表达阳性细胞明显多于SAL对照组，与SAL对照组比差异非常显著(P＜0.05，P＜0.01)；伤后各时间点二甲胺四环素治疗组bax阳性表达细胞与SAL对照组比较无显著性差异(P＞0.05)。伤后各观察时间点，二甲胺四环素治疗组caspase-3阳性表达细胞明显少于SAL对照组，与SAL对照组比差异非常显著(P＜0.05，P＜0.01)。6．二甲胺四环素治疗组，伤后7～28d，大鼠后肢运动功能评分明显高于SAL对照组，与对照组比差异显著(P＜0.05，P＜0.01)；大鼠SCI伤后4周，脊髓损害面积明显小于SAL对照组，与对照组比差异非常显著(P＜0.01)；二甲胺四环素治疗组与MP治疗组后肢运动功能评分比较，两组无显著性差异(P＞0.05)。结论1．急性SCI后，损伤区脊髓组织中bcl-2、bax和caspase-3 mRNA及蛋白水平明显升高，与细胞凋亡有明显的相关性，提示bcl-2、bax和caspase-3在脊髓继发性损伤过程中起重要作用。2．二甲胺四环素能明显抑制SCI后损伤区脊髓组织中促凋亡基因caspase-3的表达，上调抑凋亡基因bcl-2的表达，表明甲胺四环素能减轻SCI后损伤局部的细胞凋亡。3．二甲胺四环素能明显减少SCI后的损伤范围并促进大鼠后肢运动功能的恢复，提示二甲胺四环素在脊髓继发性损伤过程中具有显著的神经保护作用，是SCI后药物治疗可能的理想选择之一。4．二甲胺四环素对SCI后的神经保护作用一个可能的机制是：通过抑制SCI后损伤区脊髓组织中caspase-3的表达及上调bcl-2的表达，减轻SCI后细胞凋亡，从而促进功能恢复。