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目的:1、比较骨形态发生蛋白2(BMP2)和BMP7和化学诱导配方(地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸钠)诱导MC3T3-E1细胞成骨分化的能力,为下一步实验中缓释材料负载因子的选取提供依据。2、虽然BMPs在许多临床应用中被用来促进骨形成,但是,BMPs在体内固有的不稳定,因此需要与载体结合进行控制性递送。本研究开发了一种新型高效的纤维蛋白胶/纤维粘连蛋白/肝素(FG/Fn/Hep)为载体的BMP2缓释体系,用于骨缺损修复。研究方法:1、在比较BMP2、BMP7和化学配方的成骨诱导效果的实验中,通过茜素红染色钙结节,定量检测碱性磷酸酶(ALP),免疫组化和ELISA检测RUNT相关转录因子-2(RUNX-2)、骨桥蛋白(OPN)和骨钙素(OCN)的表达来评价成骨诱导效果。2、在制备新型的FG/Fn/Hep-BMP2缓释体系并评价其骨修复性能的实验中,设计纤维蛋白胶作为组织修复细胞浸润的临时支架,纤维粘连蛋白为细胞提供粘附位点,并作为纤维蛋白和肝素之间的连接器,肝素作为控制释放BMP2和防止BMP2被体内蛋白酶降解的储存库。通过体外释放实验检测缓释体系释放BMP2情况。通过MC3T3-E1细胞诱导实验检测缓释体系诱导细胞成骨能力,并检测MC3T3-E1细胞成骨特征指标,包括钙结节、ALP、RUNX-2、OPN、OCN和Ⅰ型胶原蛋白(COL-Ⅰ)。最后进行大鼠颅骨植入实验,使用缓释材料修复大鼠颅骨临界缺损,通过X线扫描和Giemsa染色来评估缓释体系在体内修复骨缺损能力。结果:1、在比较BMP2、BMP7和化学配方的成骨诱导效果的实验中,茜素红染色结果、ALP定量检测、免疫组化和ELISA检测结果表明,在第7天,各诱导组(化学组,BMP2,BMP7,BMP2+BMP7)诱导MC3T3-E1细胞均出现少量钙结节,且各组间ALP表达量无显著差异。BMP2组中的RUNX-2表达量较其它组增加显著,而化学组中的OPN表达量较其它组有显著增加。此时,各组间OCN表达量无显著差异。在第14天,各诱导组均出现大量钙结节,化学组和BMP2组的钙结节着色面积较大。BMP2组和BMP2+BMP7组中的ALP表达量较其它组有显著增加。化学组和BMP2组中的RUNX-2表达量较其它组增加显著。各诱导组的OPN表达量均较对照组有显著增加,此时,化学组的OPN表达量仍然最高,且各诱导组的OCN的表达量均较对照组有显著差异。在第21天,化学组、BMP2组和BMP2+BMP7组的钙结节着色面积显著增大,而BMP7组较第14天增加不明显。BMP2组中的ALP表达量较其它组有显著差异。此时,BMP2组中的RUNX-2表达下降,化学组较其它组的RUNX2表达量仍有显著差异,且各诱导组的OPN表达量有所下降,此时仅化学组和BMP2组较对照组有显著差异,化学组的OPN表达量仍然最高。各诱导组的OCN的表达量均较对照组有显著差异。在诱导MC3T3-E1细胞成骨分化的过程中,BMP2与BMP7的协同效果不显著。实验结果表明化学配方和BMP2的诱导效果比较突出,不过由于化学配方中的一些成分,比如地塞米松,对骨骼的愈合有一定的副作用,所以我们选用BMP2作为缓释材料的负载因子。2、在制备新型的FG/Fn/Hep-BMP2缓释体系实验中,纤维粘连蛋白和肝素的掺入可显著减缓BMP2的释放,而基本上不影响纤维蛋白胶的结构和硬度。FG/Fn/Hep-BMP2水凝胶释放BMP2主要是由于水凝胶降解而不是简单扩散。体外释放实验和MC3T3-E1细胞诱导实验表明,水凝胶可显著减少BMP2的初始爆发,使得BMP2可以平稳释放并诱导MC3T3-E1细胞分化为成骨细胞,并取得与每隔两天直接加入BMP2相近的诱导效果。其特征成骨指标,钙结节,ALP,与RUNX-2,OPN,OCN和COL-Ⅰ均比对照组有显著增加。大鼠颅骨X线扫描和Giemsa染色评估显示,当填充FG/Fn/Hep-BMP2水凝胶时,骨缺损区域愈合急剧加快。在愈合三个月后,超过80%的原始缺损区域被钙化组织覆盖。结论:1、化学配方和BMP2成骨分化诱导能力显著,较BMP7成骨诱导能力强。2、在诱导细胞成骨期间,BMP2组中的RUNX-2和ALP表达量较高,而RUNX-2和ALP均是成骨早期标志物,表明BMP2在成骨早期诱导效果更为显著。3、综合各成骨指标表达情况,BMP2和BMP7的联合诱导效果不佳。4、FG/Fn/Hep-BMP2水凝胶显著促进MC3T3-E1细胞成骨分化以及大鼠颅骨临界尺寸缺损模型中的骨再生,有望用于修复骨缺损。