戊型肝炎(戊肝,HE)是一种世界范围内危害严重的传染病,由戊型肝炎病毒(HEV)感染引发,其中孕妇病死率可高达20%。据估计全球约有1/3的人口感染过HEV,发达国家的戊型肝炎散发病例也逐年增多。我国属于戊型肝炎高发流行地区,各地广泛存在散发性戊型肝炎。目前全世界唯一上市的戊肝预防性疫苗Hecolin(?)由本实验室和厦门万泰沧海生物科技有限公司联合研制,其抗原成分为HEV ORF2编码的a.a.368-a.a.606截短蛋白p239,该蛋白能够形成稳定的VLP结构并且能激发机体产生针对HEV较强的免疫保护。虽然Hecolin(?)有较多的研究支持以及较为严格完善的生产工艺,但仍需要进一步完善疫苗质量分析系统以及稳定性研究。疫苗免疫学分析方法相对于生物物理、生物化学分析方法是一类特异性针对疫苗抗原高级构象的分析方法。其中,疫苗体外免疫化学质量分析以其成本低、误差小、周期短等诸多优势,近年来逐渐部分替代了作为疫苗的效价测定金标准的体内动物试验,并在某些重组VLP疫苗(如HPV疫苗Gardasil(?))上证实了与动物试验(ED50)结果的良好相关性。针对关键免疫优势表位及中和表位的分析可实现对重组VLP(?)苗免疫原性的有效体外评估,这提示了基于体外免疫化学分析方法的疫苗体外相对效价评估(IVRP)可很好地应用于疫苗工艺控制、不同批次疫苗放行以及稳定性考察工作。本研究旨在建立HEV疫苗Hecolin(?)的多表位免疫化学质量分析系统并将其应用于稳定性研究,利用多个疫苗表位区抗体的体外免疫化学质量分析系统则能从多个抗原角度上对重组HEV疫苗进行全面的构象和活性监控。首先,对本实验室现有27株p239单抗的交叉阻断信息进行聚类分析,根据不同p239结合表位区将单抗分为6个分群A1-A6,同时进行与p239结合活性、对p239构象敏感性等抗体性质的定量分析。然后从5个p239表位区内根据抗体的血清阻断率、结合活性、构象敏感性等筛选获得9株代表性单抗用于HEV疫苗的免疫化学质量分析。其次,利用筛选出的单抗组合建立了 HEV疫苗免疫化学质量分析系统,包括:基于无分子标记测定的表面等离子共振法(SPR法)、基于抗原“溶液中”构象测定的竞争ELISA系统(rIC50法)以及基于8C11关键表位测定的双抗夹心ELISA系统(rEC50法)。其中,在rEC50法中引入了“平行线分析”的数据处理模型,对ELISA结果进行数据质量控制及有效拟合,保证了试验的可重复性和数据的可靠性。上述三种免疫化学分析系统分别涉及6株、5株和2株单抗,均进一步应用于不同批次(6批)疫苗原液的体外相对效价评估(IVRP)并考察了检测方法的重现性,证明了不同疫苗批次的一致性。这三种分析方法还能应用于HEV疫苗批次放大后的“可比性分析”或QbD(Quanlity by Design)系统完善中。最后,本研究还初步应用HEV疫苗多表位免疫化学质量分析系统于Hecolin(?)及疫苗蛋白的稳定性研究中。对HEV疫苗蛋白在不同温度、pH、盐浓度、添加剂条件下的稳定性进行了考察,并对建立的免疫化学分析系统与传统的SDS-PAGE、SEC-HPLC、DSC等进行比较,发现具有一定的相关性。对HEV疫苗的热加速试验不仅完善了疫苗的稳定性信息,还证明了铝佐剂对疫苗稳定性的增强作用。系统的免疫分析手段及HEV疫苗稳定性信息为后续IVRP替代动物试验研究、支持市场需求的疫苗工艺放大以及HEV联合苗的研发提供了有力的技术保证和数据支持。综上所述,本研究建立了 HEV疫苗的多表位免疫化学质量分析系统并初步将其应用于疫苗稳定性研究。这种分析系统的建立不仅为HEV疫苗的体外相对效价评估奠定了基础,相对于动物试验大大降低了检测成本和分析周期,还为今后其它重组VLP疫苗的相对效价评估提供了借鉴模式。