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布鲁氏菌病（Brucellosis）是一种由布鲁氏菌（Brucella）引起的人兽共患的世界范围流行性疾病。目前，预防布鲁氏菌病最广泛应用的疫苗为减毒活疫苗，但减毒活疫苗对接种的动物和人可能会造成感染，而且易发生返祖现象。基因工程疫苗可以克服这一问题，但普通的基因工程疫苗通常采用注射的方式接种，不能引发粘膜免疫。转基因植物疫苗则可克服以上缺点，与一般的基因工程疫苗相比，转基因植物疫苗成本低，更安全，而且还能使机体产生粘膜免疫。为构建植物疫苗做准备，本实验构建了布菌抗原蛋白基因在烟草中的瞬时表达系统，并快速高效检测布菌抗原蛋白是否在植物中表达，此实验建立的布菌抗原蛋白基因植物细胞瞬时表达系统对后续研究转布菌抗原基因植物疫苗奠定了重要的基础。具体内容如下： 1.分别以布菌基因组和含有布菌融合抗原基因的质粒pJG045-Omp3148-74-BLS为模板，经PCR扩增得到Omp10、Omp28、Omp3148-74-BLS基因片段，采用无需限制性构建无缝质粒载体的方法，成功构建了含Omp10、Omp28、Omp3148-74-BLS布菌抗原基因的pET28a原核表达载体。经PCR、双酶切和测序鉴定正确后，IPTG诱导表达布菌抗原蛋白。SDS-PAGE电泳结果显示：IPTG诱导表达出的3种布菌抗原基因的蛋白条带，与实际目的蛋白大小相符。 2.诱导后的含重组质粒pET28a-Omp3148-74-BLS的TL129菌体经超声波处理和破碎包涵体处理，用NI-IDA琼脂糖亲和层析柱法纯化了目的蛋白，用纯化后的目的蛋白免疫家兔，得到兔抗布菌抗原蛋白的抗血清，获取的抗血清通过Western blot和间接ELISA实验检验其免疫效果。结果显示：所制备的多克隆抗体能特异性识别融合蛋白Omp3148-74-BLS，而未免疫兔的血清并不与融合蛋白产生特异性免疫反应，表明目的蛋白对动物具有良好的抗原特异性。 3.将PCR扩增得到L7/L12、Omp10、Omp19、Omp28、Omp31基因克隆到植物表达载体pJG053上，经PCR、双酶切和测序鉴定正确后，这些载体将用于后续对布菌各个抗原基因的抗原性与免疫原性的分析。 4.将构建成功的携带布菌抗原蛋白L7/L12、Omp10、Omp19、Omp28、Omp31、Omp3148-74-BLS基因的pJG053植物表达载体利用电击转化法转化入农杆菌GV3101。通过菌落PCR，筛选出阳性农杆菌利用注射渗透法侵染烟草，侵染后的烟草叶片在100倍荧光倒置显微镜下观察，结果显示：携带有目的蛋白基因重组载体在农杆菌GV3101侵染的烟草叶片中检测到报道荧光蛋白EGFP，表明布菌抗原蛋白基因已经成功导入到了烟草叶片中。 5.对观察到有绿色荧光蛋白表达的叶片提取总RNA，RT-PCR检测进一步证明了布菌抗原蛋白基因在烟草叶片中成功进行了转录。 6.粗提转Omp3148-74-BLS基因烟草的植物总可溶性蛋白，对在烟草中表达的Omp3148-74-BLS布菌抗原蛋白进行ELISA检测检验其蛋白表达效果。结果显示：Omp3148-74-BLS蛋白成功在烟草中瞬时表达并与抗血清发生特异性反应。