帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种多发于中老年人的中枢神经系统退行性疾病,其神经病理学特征是黑质(substantia nigra,SN)致密带多巴胺(dopamine,DA)能神经元的退变缺失,由此导致的纹状体(striatum,Str)DA含量下降,进一步造成在运动调控中起重要作用的基底神经节运动环路损毁。目前PD的病因尚未阐明,越来越多的证据证实SN铁聚集是PD DA能神经元损伤的重要因素。已证实PD SN铁聚集主要与铁转入蛋白二价金属离子转运蛋白1(divalent metal transporter 1,DMT1)以及铁转出蛋白ferroportin1(Fpn1)的表达失调有关。因此,对铁转运蛋白的调控研究将为阐明PD铁聚集的机制提供理论依据。N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-asparate,NMDA)受体是一种介导兴奋性神经传递的谷氨酸受体,参与调节神经系统的多种重要生理功能。NMDA受体异常激活引起的兴奋性神经毒性是PD SN神经元损伤的重要原因。NMDA受体的激活可以通过其偶联的钙离子门控通道引发钙离子内流,活化神经型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,n NOS)产生NO,从而引起细胞的兴奋性毒性。研究表明NMDA受体的激活可以增强PC12细胞摄铁功能从而增加细胞内铁水平,提示NMDA受体的激活可能参与神经细胞铁调控。但是NMDA受体的激活在PD DA神经元铁聚集中的作用及机制尚不清楚。本室前期研究表明在PD状态下DMT1及Fpn1的表达异常可能与铁调节蛋白(iron regulatory proteins,IRPs)的调控异常有关。由此我们推测NMDA受体的激活可能通过活化n NOS合成NO,从而激活IRPs,通过IRPs/铁反应元件(iron responsive element,IRE)系统上调DMT1并下调Fpn1的表达,最终引起细胞铁聚集。为验证上述推测,本研究选用DA能神经细胞系MES23.5细胞,应用细胞培养、流式细胞仪、荧光实时定量PCR(real-time PCR)及免疫蛋白印记(Western blots)等多种技术方法检测NMDA受体激活对MES23.5 DA能神经细胞铁转运功能及铁转运蛋白DMT1和Fpn1表达的影响,并在6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)制备的PD细胞模型上,观察NMDA受体抑制剂地佐环平(dizocilpine,MK-801)对6-OHDA诱导的细胞铁转运功能、IRP1、铁转运蛋白DMT1和Fpn1的m RNA及蛋白表达水平的影响并进一步阐明其机制。结果如下:1.50μM NMDA预处理MES23.5细胞24 h后,细胞的摄铁能力与单独铁负载组相比增强18.1%,差异有显著性(P<0.05)。铁负载后细胞线粒体跨膜电位差较对照组降低9.62%,50μM NMDA预处理24 h后能够增强铁诱导的线粒体膜电位损伤,线粒体跨膜电位差与单独铁负载组相比降低8.64%,差异有显著性(P<0.05)。2.50μM NMDA处理MES23.5细胞24 h后,DMT1+IRE的m RNA水平与对照组相比上调99.9%,差异有显著性(P<0.01),Fpn1的m RNA水平与对照组相比下调29%,差异有显著性(P<0.05)。3.10μM 6-OHDA处理MES23.5细胞24 h后,细胞摄铁能力与对照组相比增强21%,差异有显著性(P<0.001)。NMDA受体阻断剂MK801预处理后细胞摄铁能力与6-OHDA组相比降低了12%,差异有显著性(P<0.05)。4.10μM 6-OHDA处理MES23.5细胞24 h后,细胞内铁水平与对照组相比增加24%,差异有显著性(P<0.01)。MK801预处理组细胞内铁水平与6-OHDA组相比降低43%,差异有显著性(P<0.001)。5.10μM 6-OHDA处理MES23.5细胞24 h后,细胞内DMT1+IRE的m RNA水平与对照组相比上调38%,Fpn1的m RNA水平与对照组相比下调30%,差别有统计学意义(P<0.05)。MK801预处理能够明显拮抗6-OHDA诱导的DMT1+IRE的m RNA水平的上调(P<0.01)及Fpn1的m RNA水平的下调(P<0.001)。6.10μM 6-OHDA处理MES23.5细胞24 h后,细胞内DMT1的蛋白表达量与对照组相比上调52%,Fpn1的蛋白表达量与对照组相比下调41%,差异有显著性(P<0.01)。MK801预处理组DMT1蛋白表达量与6-OHDA组相比下调36%,差异有显著性(P<0.01),Fpn1蛋白表达量与6-OHDA组相比上调47%,差异有显著性(P<0.05)。7.10μM 6-OHDA处理MES23.5细胞24 h后,细胞内IRP1的m RNA水平与对照组相比上调29%(P<0.05),IRP1的蛋白表达量与对照组相比上调20%,差异有显著性(P<0.01)。MK801预处理组IRP1的m RNA水平与6-OHDA组相比下调19%,差异有显著性(P<0.05),IRP1蛋白表达量与6-OHDA组相比下调27%,差异有显著性(P<0.01)。8.MES23.5细胞孵育10μM 6-OHDA 24 h后,n NOS的蛋白表达量与对照组相比上调58%,差异有显著性(P<0.001)。9.10μM 6-OHDA处理MES23.5细胞24 h后,IRP1和DMT1+IRE的m RNA水平与对照组相比分别上调29%和38%,差异有显著性(P<0.01,0.05)。盐酸亚精胺预处理后IRP1和DMT1+IRE的m RNA水平与6-OHDA组相比下调20%和32%,差异有显著性(P<0.01,0.05)。10μM 6-OHDA处理MES23.5细胞24 h后,Fpn1的m RNA水平与对照组相比下调30%,差异有显著性(P<0.05)。盐酸亚精胺预处理组Fpn1的m RNA水平与6-OHDA组相比上调62%,差异有显著性(P<0.001)。上述实验结果表明:NMDA受体激活能够增强MES23.5细胞摄铁能力并加剧细胞内高铁造成的线粒体膜电位损伤;NMDA受体抑制剂MK801可以拮抗6-OHDA诱导的铁转运功能改变及6-OHDA引起的IRP1、DMT1的表达上调及Fpn1的下调;进一步实验结果表明,MK801减少6-OHDA诱导的MES23.5细胞铁聚集可能是通过抑制n NOS的活性而实现的。综上所述,NMDA受体异常激活导致6-OHDA诱导的MES23.5细胞铁聚集的机制可能是NMDA受体激活后活化n NOS合成NO,从而上调IRP1的表达,进而通过IRPs/IRE机制上调DMT1的表达,并下调Fpn1的表达,最终造成细胞内铁聚集。本实验结果为PD铁聚集提供了全新的实验依据和药物防治新策略。