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第一部分circ-CCDC85A在乳腺癌组织和细胞中的表达及对其生物学行为的影响目的:研究环状RNA CCDC85A在乳腺癌(Breast Cancer,BC)组织和细胞中的表达及其对乳腺癌细胞增值、迁移和侵袭能力的影响。方法:1.RT-PCR和q RT-PCR法检测circ-CCDC85A在乳腺癌组织和细胞中的表达。2.采用Sanger测序鉴定circ-CCDC85A的环化剪接点序列。3.RNase R实验验证circ-CCDC85A在乳腺癌细胞中的特性。4.采用CCK-8实验、平板克隆形成实验、划痕愈合实验以及Transwell实验检测过表达或敲低circ-CCDC85A对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。结果:1.RT-PCR结果显示,以乳腺癌组织和细胞的c DNA和g DNA为模板,环状转录本只能通过发散引物在c DNA中扩增出来,而线性转录本可通过聚合引物同时在c DNA和g DNA中扩增出来。q RT-PCR结果显示,与癌旁正常组织相比,乳腺癌组织中circ-CCDC85A表达水平显著下调(P<0.05)。2.PCR产物的Sanger测序结果验证了circ-CCDC85A的环化剪接点序列。3.RNase R实验结果显示,circ-CCDC85A比其相应的线性转录本更能耐受RNase R的抑制作用(P<0.05)。4.CCK-8实验和平板克隆形成实验结果显示,过表达circ-CCDC85A可抑制MDA-MB-231细胞的增殖能力(P<0.05);而敲低circ-CCDC85A可增强MCF-7细胞的增殖能力(P<0.05)。划痕愈合实验和Transwell实验结果显示,过表达circ-CCDC85A可抑制MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力(P<0.05);而敲低circ-CCDC85A可增强MCF-7细胞的迁移和侵袭能力(P<0.05)。小结:1.乳腺癌患者肿瘤组织中circ-CCDC85A的表达明显低于癌旁正常组织。2.过表达circ-CCDC85A能抑制乳腺癌细胞的增殖,迁移和侵袭能力;敲低circ-CCDC85A能增强乳腺癌细胞的增殖,迁移和侵袭能力。第二部分circ-CCDC85A在乳腺癌中对IL-6R和STAT3调控机制的研究目的:探讨circ-CCDC85A通过作为mi RNA的贮库调控其下游靶基因白介素6受体和STAT3的表达进而揭示circ-CCDC85A在乳腺癌中发挥抑癌作用的可能机制。方法:1.通过Miranda和Circ Net在线数据库预测可能与circ-CCDC85A相互作用的mi RNA分子及其结合位点。2.q RT-PCR法检测过表达或敲低circ-CCDC85A后乳腺癌细胞中mi R-660-3p的表达变化。3.采用RIP实验和放线菌素D实验验证circ-CCDC85A是否能与mi R-660-3p相互作用。4.采用CCK-8实验、平板克隆形成实验、划痕愈合实验以及Transwell实验检测过表达或敲低mi R-660-3p对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。5.通过挽救实验检测过表达mi R-660-3p和敲低circ-CCDC85A对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。6.通过Target Scan在线数据库预测mi R-660-3p下游的靶基因。7.采用双荧光素酶报告基因实验验证mi R-660-3p是否能与白介素6受体基因和STAT3基因相互作用。8.采用q RT-PCR检测乳腺癌细胞中过表达mi R-660-3p和敲低circ-CCDC85A后白介素6受体和STAT3 m RNA的表达变化。9.采用Western blot实验检测乳腺癌细胞中过表达mi R-660-3p和敲低circ-CCDC85A后白介素6受体和STAT3蛋白的表达变化。结果:1.Miranda在线数据库分析结果显示,circ-CCDC85A和mi R-660-3p存在2个结合位点。Circ Net在线数据库预测结果显示,circ-CCDC85A可能与mi R-660-3p相互作用。2.q RT-PCR结果显示,过表达circ-CCDC85A后MDA-MB-231细胞中mi R-660-3p基因表达水平显著升高(P<0.05);敲低circ-CCDC85A后MCF-7细胞中mi R-660-3p基因表达水平显著降低(P<0.05)。3.RIP实验结果显示,circ-CCDC85A在乳腺癌细胞中能与mi R-660-3p相互作用(P<0.05)。4.放线菌素D实验结果显示,circ-CCDC85A在乳腺癌细胞中能影响mi R-660-3p基因的稳定性(P<0.05)。5.CCK-8实验和平板克隆形成实验结果显示,过表达mi R-660-3p可抑制MDA-MB-231细胞的增殖能力(P<0.05);而敲低mi R-660-3p可增强BT-549细胞的增殖能力(P<0.05)。划痕愈合实验和Transwell实验结果显示,过表达mi R-660-3p可抑制MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力(P<0.05);而敲低mi R-660-3p可增强BT-549细胞的迁移和侵袭能力(P<0.05)。6.挽救实验结果显示,敲低circ-CCDC85A可促进乳腺癌细胞的增殖,迁移和侵袭能力(P<0.05),而再过表达mi R-660-3p后可部分缓解敲低circ-CCDC85A引起的乳腺癌细胞增殖,迁移和侵袭能力的增强(P<0.05)。7.Target Scan在线数据库预测结果显示,mi R-660-3p与白介素6受体和STAT3 3’UTR存在结合位点。8.双荧光素酶报告基因实验结果显示,mi R-660-3p能影响白介素6受体和STAT3基因的活性(P<0.05)。9.q RT-PCR结果显示,单独过表达mi R-660-3p后MDA-MB-231细胞中白介素6受体和STAT3 m RNA的表达水平无明显变化(P>0.05),单独敲低circ-CCDC85A后MDA-MB-231细胞中白介素6受体和STAT3 m RNA的表达水平无明显变化(P>0.05),而同时过表达mi R-660-3p和敲低circ-CCDC85A后白介素6受体和STAT3 m RNA的表达水平无明显变化(P>0.05)。10.Western blot结果显示,单独过表达mi R-660-3p后MDA-MB-231细胞中白介素6受体和STAT3蛋白的表达水平明显降低(P<0.05),单独敲低circ-CCDC85A后MDA-MB-231细胞中白介素6受体和STAT3蛋白的表达水平明显升高(P<0.05),而同时过表达mi R-660-3p和敲低circ-CCDC85A后白介素6受体和STAT3蛋白的表达水平较单独敲低circ-CCDC85A明显恢复(P<0.05)。小结:1.在乳腺癌细胞中circ-CCDC85A可与mi R-660-3p互相结合。过表达circ-CCDC85A可促进mi R-660-3p基因的表达,敲低circ-CCDC85A可抑制mi R-660-3p的表达。2.过表达mi R-660-3p能抑制乳腺癌细胞的增殖,迁移和侵袭能力;敲低mi R-660-3p能增强乳腺癌细胞的增殖,迁移和侵袭能力。而且mi R-660-3p的过表达拮抗了circ-CCDC85A的敲低对乳腺癌细胞增殖,迁移和侵袭的促进作用。3.mi R-660-3p可直接靶向白介素6受体和STAT3,并至少部分通过抑制白介素6受体和STAT3的表达来发挥抑癌作用。4.mi R-660-3p的过表达可以有效逆转在蛋白质水平上circ-CCDC85A的敲低介导的IL-6R和STAT3表达的上调。结论:环状RNA circ-CCDC85A在乳腺癌组织中表达下调,且能抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并可通过作为mi R-660-3p的分子贮库,促进mi R-660-3p对白介素6受体和STAT3的靶向调控,从而发挥其在乳腺癌中的抑癌作用。我们的研究提供了circ-CCDC85A作为“mi RNA贮库”的新证据,也为乳腺癌的研究提供了新的潜在生物标记物和治疗靶点。