研究背景2013年3月30日,中国华东地区出现了可引起严重人类呼吸道感染的新型甲型H7N9禽流感病毒。从2013年3月到5月,全国一共报道了 133例感染H7N9病毒的患者,主要分布于华东的长江三角洲地区。随后,全国人感染H7N9禽流感疫情出现了明显缓解,广东省仅在8月10日报告了本省第一例人感染A/Guangdong/1/2013(H7N9)禽流感病毒的病例。直到2015年9月底,全国共报告679人感染H7N9禽流感病毒病例,有271人死亡,其中2013-2015年,广东省共报告人感染H7N9禽流感病毒病例183例。该病毒的迅速蔓延严重威胁公众健康,并引起了政府部门的高度重视。疫情发生后不久,国家卫生和计划生育委员会以及中国疾病预防控制中心发布了《人感染H7N9禽流感诊疗方案(2014年版)》,重点是加强临床诊断和治疗,特别强调了早期病例的早发现、早诊断和早治疗。要求尽早给予神经氨酸酶抑制剂类药物的抗流感病毒治疗。神经氨酸酶(neuraminidase,NA)是流感病毒包膜表面的糖蛋白,由流感病毒的第6段基因编码,作用是在病毒成熟的过程中催化唾液酸与糖蛋白之间糖苷键的水解,这有助于感染细胞释放子代病毒颗粒。国内临床上常用的神经氨酸酶抑制剂(NAIs)包括:帕拉米韦、奥司他韦、扎那米韦等。这类药物通过阻止被感染细胞释放新的病毒颗粒从而达到抑制流感病毒复制增殖的效果。已有的研究结果显示,尽早使用神经氨酸酶抑制剂对治疗人感染H5N1等禽流感病毒病例有效。但根据我国的《人感染H7N9禽流感诊疗方案(2014年版)》,临床医生是否抓住了神经氨酸酶抑制剂治疗的最佳时机?神经氨酸酶抑制剂对H7N9禽流感感染的实际治疗效果如何?特别是大量使用神经氨酸酶抑制剂会不会引起病毒对药物的耐药性?为了科学回答这些问题,我们有必要对2013-2015年广东省人感染H7N9禽流感病病例临床治疗使用神经氨酸酶抑制剂情况进行回顾性分析,并对分离自人感染H7N9禽流感病毒病例的毒株进行对神经氨酸酶抑制剂的敏感性及其分子特征进行分析研究。本研究收集来自国家禽流感监测网络数据库的2013-2015年183例广东省人感染H7N9禽流感病毒病例的流行病学数据和临床数据,分析发病至实验室确诊之间的时间间隔以及发病至第一次接受神经氨酸酶抑制剂治疗之间的时间间隔,以了解广东省应对H7N9禽流感的诊断能力和及时治疗能力;对40株2014-2016年广东省人感染H7N9禽流感病毒株进行神经氨酸酶抑制敏感性试验(NAI assay),分析广东省内流行的人感染H7N9禽流感病毒对3种神经氨酸酶抑制剂(奥司他韦、帕拉米韦和扎那米韦)的敏感性,为H7N9禽流感病例的临床合理用药提供实验依据;利用Ion Torrent高通量测序技术对2014-2016年40株广东省人感染H7N9禽流感病毒进行全基因组测序并对其相关致病位点进行分析,了解并跟踪该病毒在流行过程中的变异情况,为今后有效防治H7N9禽流感提供科学有效的依据。研究目的1.分析2013-2015年183例广东省H7N9禽流感病例的流行病学数据和临床数据,了解广东省应对H7N9禽流感的诊断能力和治疗能力;2.通过检测病毒表型的方法,了解广东省内流行的人感染H7N9禽流感病毒对3种神经氨酸酶抑制剂(奥司他韦、帕拉米韦和扎那米韦)的敏感性,为H7N9禽流感病例的临床合理用药提供实验依据;3.分析广东省内流行的人感染H7N9禽流感病毒神经氨酸酶抑制剂耐药关键位点和致病相关位点,了解并跟踪该病毒在流行过程中的变异情况,为今后有效防治H7N9禽流感提供科学有效的依据。研究方法1.数据来源:2013-2015年183例广东省H7N9禽流感病例的流行病学数据和临床数据均来自国家禽流感监测网络数据库。2.病毒来源:40株实验病毒株为2014-2016年间广东省疾病预防控制中心从全省各地收集的人感染H7N9禽流感病毒病例分离的毒株。3.研究方法:通过箱式图分析(box-and-whisker plot analysis)和曼-惠特尼秩和检验(Mann-Whitney U test)计算和分析发病至实验室确认之间的时间间隔以及发病至第一次接受神经氨酸酶抑制剂治疗之间的时间间隔。应用分层随机抽样方法抽取实验毒株;采用神经氨酸酶抑制试验(NAI assay)检测实验毒株对3种神经氨酸酶抑制剂(奥司他韦、帕拉米韦和扎那米韦)的半数最大抑制浓度(half maximal inhibitory concentration;IC50);采用单因素方差分析法比较三种药物针对人感染H7N9禽流感病毒的半数最大抑制浓度IC50的差异;采用L-S-D法(最小显著性差异法,Least Significant Difference)对三种药物半数最大抑制浓度IC50进行两两比较。利用Ion Torrent高通量测序技术对40株广东省人感染H7N9禽流感病毒进行全基因组测序,使用MEGA7.0软件进行序列比对,找出耐药相关位点和致病相关位点并对其进行分析。利用糖基化预测器对其进行潜在糖基化位点的氨基酸序列分析。研究内容1.收集来自国家禽流感监测网络数据库的2013-2015年183例广东省H7N9禽流感病例的流行病学和临床数据,分析发病至实验室确诊之间的时间间隔以及发病至第一次接受神经氨酸酶抑制剂治疗之间的时间间隔,以了解广东省应对H7N9禽流感的诊断能力和及时治疗能力;2.对所选广东省人感染H7N9禽流感病毒分离株进行神经氨酸酶抑制试验(NAI assay)。分析广东省内流行的人感染H7N9禽流感病毒对3种神经氨酸酶抑制剂(奥司他韦、帕拉米韦和扎那米韦)的敏感性;3.对所选广东省人感染H7N9禽流感病毒分离株进行高通量测序并分析广东省内流行的人感染H7N9禽流感病毒致病相关位点。研究结果1.通过分析来自国家禽流感监测网络数据库183例广东省H7N9禽流感病例的流行病学和临床数据,发现发病至实验室确诊之间的时间间隔,2015年(median:8.0days,interquartile ranges:4.25-9.0 days)与 2013-2014 年(median:8.0days,interquartile ranges:6.0-11.0days)相比,发病与实验室确诊之间的时间间隔显着减少(p<0.01,Mann-Whitney U test)。此外,在183例病例中,145例(79.23%)接受了至少一种神经氨酸酶抑制剂治疗。研究发病至第一次接受神经氨酸酶抑制剂治疗之间的时间间隔发现,2015年时间间隔(median:5.0days,interquartile ranges:3.0-7.0 days)比前两年(median:6.0 days,interquartile ranges:4.0-8.0 days)显着减少(p = 0.03,Mann-Whitney U test)。2.40株人感染H7N9禽流感毒株中没有发现对检测的三种药物(帕拉米韦、奥司他韦、扎那米韦)耐药的毒株,提示本次研究中毒株对三种神经氨酸酶抑制剂均敏感。帕拉米韦、奥司他韦、扎那米韦的半数最大抑制浓度IC50(x±SD)nmol/L 分别为(0.56±0.23)nmol/L、(1.31±0.27)nmol/L 和(4.38±0.26)nmol/L。比较三种药物针对H7N9禽流感病毒的半数最大抑制浓度IC50差异有统计学意义(p<0.001)。对三种药物半数最大抑制浓度IC50进行进一步两两比较发现,帕拉米韦与奥司他韦半数最大抑制浓度IC50值间差异、帕拉米韦与扎那米韦半数最大抑制浓度IC50值间差异、奥司他韦与扎那米韦半数最大抑制浓度IC50值间差异均有统计学意义(p<0.001),即人感染H7N9病毒对不同神经氨酸酶抑制剂的敏感性为:帕拉米韦>奥司他韦>扎那米韦。3.40株人感染H7N9禽流感病毒包膜表面糖蛋白HA受体结合位点(H3 numbering)G186V和Q226L均发生了氨基酸突变,提示广东省内流行的人感染H7N9禽流感病毒普遍获得与人上呼吸道上皮细胞唾液酸α2,6半乳糖受体结合的分子基础。本次研究中的40株人感染H7N9禽流感病毒并无出现HA蛋白(H3 numbering)110Y/160A/226L/228S、158D/224K/226L、196R/226L/228S 中任意一种突变组合,提示人感染H7N9禽流感病毒通过飞沫传播从而进行人-人传播的可能性较小。4.40株人感染H7N9禽流感病毒中,有26株(65.0%)病毒发生了 PB2蛋白的 E627K 位点突变,有 1株(2.5%)病毒 A/Guangdong/10/2015(H7N9)发生了 PB2蛋白的D701N位点突变,有10株(25.0%)病毒发生了 PA蛋白的L336M位点突变,40株(100.0%)病毒均编码全长PB1-F2蛋白,该结果提示广东省内人感染H7N9禽流感病毒对人体有较强适应性。5.40株(100.0%)人感染H7N9禽流感病毒均出现了 HA蛋白(H3 numbering)D225G位点突变、NA蛋白茎杆区69-73位QISNT序列缺失、M1蛋白N30D和T215A位点突变、PB2蛋白L89V位点突变和NS1蛋白P42S位点突变。有26株(65.0%)病毒发生了 PB2蛋白的E627K位点突变,有10株(25.0%)病毒发生了 PA蛋白的L336M位点突变。以上变异结果均提示广东省内流行的人感染H7N9禽流感病毒毒力增强,这可能与人感染H7N9禽流感病毒对人类具有较高致病性有密切关系。6.40株(100.0%)人感染H7N9禽流感病毒均发现M2蛋白S31N位点突变,提示广东省内流行的人感染H7N9禽流感病毒对M2离子通道抑制剂(金刚烷胺类药物)普遍不敏感。结果显示所有的H7N9病毒株的NA蛋白均没有发生E119G、R152K、H274Y、R294K位点突变,提示了这些病毒对神经氨酸酶抑制剂未产生耐药。研究结论1.2015年与2013-2014年相比,广东省H7N9禽流感发病至实验室确诊的时间间隔减少,发病至第一次接受神经氨酸酶抑制剂治疗的时间间隔减少,体现了广东省应对H7N9禽流感的诊断能力和及时治疗能力的逐步提高。2.近三年来广东省人感染H7N9禽流感病毒对神经氨酸酶抑制剂仍有较高的敏感性,半数最大抑制浓度IC50结果提示人感染H7N9禽流感病毒对不同种神经氨酸酶抑制剂的敏感性不同,其中敏感度:帕拉米韦>奥司他韦>扎那米韦。帕拉米韦毒性小、给药途径(口服或静脉给药)方便、不易产生耐药性,是一个具有应用价值的抗流感病毒药物。3.HA受体结合位点(H3 numbering)G186V和Q226L位点突变在实验病毒株中广泛存在,提示广东省内流行的人感染H7N9禽流感病毒普遍获得与人上呼吸道上皮细胞唾液酸α2,6半乳糖受体结合的分子基础。4.结合实验病毒株中出现了 PB2蛋白E627K位点突变、PA蛋白L336M位点突变以及病毒编码全长PB1-F2蛋白,提示广东省内人感染H7N9禽流感病毒对人类有较强适应性。5.结合本次实验病毒株中出现了 HA蛋白D225G位点突变、NA蛋白颈部69-73位QISNT序列缺失、M1蛋白N30D和T215A位点突变、PB2蛋白的E627K和L89V位点突变和NS1蛋白P42S位点突变以及PA蛋白的L336M位点突变,提示广东省内流行的人感染H7N9禽流感病毒毒力增强,这可能与人感染H7N9禽流感病毒对人类具有较高致病性有密切关系。6.本次研究中所有实验病毒株均发现M2蛋白S31N位点突变,提示广东省内流行的人感染H7N9禽流感病毒对M2离子通道抑制剂(金刚烷胺类药物)普遍不敏感。结果显示所有实验株均未发现NA蛋白耐药位点突变,提示了这些病毒对神经氨酸酶抑制剂未产生耐药。神经氨酸酶抑制剂仍应是人感染H7N9禽流感患病早期的首选药物。