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为了探索ERα、PR-B基因的表达对山羊乳腺发育的影响,以及ERα、PR-B基因的甲基化与基因表达的关系,本实验通过Real-TimePCR方法对不同时期崂山奶山羊、波尔山羊乳腺组织中ERα、PR-B基因的表达进行检测,并利用亚硫酸盐测序法,分析了相应时期ERα、PR-B基因的甲基化水平,旨在发现青春期、妊娠期、泌乳期和退化期崂山奶山羊和波尔山羊乳腺组织中ERα、PR-B基因的表达以及甲基化的变化规律,揭示山羊乳腺ERα、PR-B基因的甲基化与基因表达的关系。
根据山羊乳腺发育特点,采样时点分为:青春期、妊娠早期、妊娠中期、妊娠晚期、泌乳早期、泌乳晚期扣退化期。为了检测ERα和PR-B基因的表达情况,分别以7个时期崂山奶山羊、波尔山羊乳腺组织的cDNA为模板,以β-actin为内参基因,每一时期设3个重复,进行Real-timePCR扩增。ERα基因的定量结果显示,不论崂山奶山羊还是波尔山羊,青春期、妊娠早期、妊娠中期ERα的表达量较高,且呈上升趋势,妊娠晚期表达量急剧下降,此后维持在较低水平。此外,青春期、妊娠早期、妊娠中期崂山奶山羊的表达量显著高于波尔山羊(青春期P=0.004<0.01;妊娠早期P=0.01<0.05;妊娠中期P=0.023<0.05),其它时期差异不显著。PR-B基因的定量结果显示,不论崂山奶山羊还是波尔山羊,PR-B基因在青春期表达量很低,妊娠期表达量较高,且呈上升趋势,妊娠晚期达到最大值。分娩后表达量急剧下降,此后维持低水平。其中妊娠中期、妊娠晚期崂山奶山羊的表达量显著高于波尔山羊(妊娠中期P=0.011<0.05;妊娠晚期P=0.004<0.01)。其它时期差异不显著。
为了检测ERα和PR-B基因的甲基化状态,各取崂山奶山羊和波尔山羊7个时期的乳腺组织,亚硫酸盐测序法分析ERα和PR-B基因的甲基化水平。ERα基因在崂山奶山羊各时期的甲基化比率分别为5.00%,3.75%,3.75%,0%,9.38%,10.63%,10.63%;在波尔山羊各时期的甲基化比率分别为6.25%,4.38%,3.75%,0%,8.13%,11.88%,10.63%。PR-B基因在崂山奶山羊各时期的甲基化比率分别为13.33%,9.33%,2.00%,0%,8.67%,10.67%,10.67%;在波尔山羊各时期的甲基化比率分别为12.00%,9.33%,2.67%,0%,10.67%,10.67%,11.33%。
用SAS9.0软件对甲基化与基因表达的关系进行相关性分析,分析结果显示:PR-B基因的甲基化与基因表达存在负相关关系,崂山奶山羊中相关系数为-0.866,P=0.01<0.05,波尔山羊中相关系数为-0.901,P=0.006<0.01。妊娠晚期ERα基因的甲基化与基因表达无相关性表现,其它时期仍表现为强负相关关系,崂山奶山羊的相关系数为-0.993,P=0<0.01,波尔山羊的相关系数为-0.951,P=0.004<0.01。