论文部分内容阅读
目的:下丘脑-垂体-性腺轴(Hypothalamic-Pituitary-Gonadal axis,HPGA)是生殖内分泌信息传递的重要神经网络,在调控青春期启动中处于核心地位,而促进HPGA激活和性成熟的关键是促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing Hormone,Gn RH)的脉冲式释放,并且Kisspeptins及其受体GPR54是调节HPGA活化和Gn RH释放的重要组件。目前,有少量流行病学调查资料提示,某些镰刀菌毒素污染可能促使HPGA激活提前,导致Gn RH脉冲释放的时间提前或释放量增加,进而破坏机体正常的青春期启动和性发育过程,引发中枢性性早熟(Central Precocious Puberty,CPP)。然而,对于镰刀菌毒素引起CPP的证据和是否通过Kisspeptins/GPR54信号通路发挥作用尚不十分清楚。另外,由于下丘脑中Gn RH神经元分布比较分散,很难精准定位,不利于具体信号通路的阐明,因此,选用合适的体外模型和合理的镰刀菌毒素污染模式阐述中枢性性早熟的发生及可能机制十分必要,同时,构建诱发CPP发生的AOP工作框架,也将为霉菌毒素的生殖毒性风险及食品安全评价提供数据支持,并开拓霉菌毒素风险评估新思路。方法:本研究针对HPGA启动的中枢环节,即Gn RH的释放,利用永生化的下丘脑神经元GT1-7细胞模型,选择粮食污染中常见共存污染的霉菌毒素——T-2毒素和玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN),采用MTT法评价T-2毒素和ZEN单独或联合暴露对GT1-7细胞的毒性作用后,选择相应的非致死剂量(T-2毒素剂量为0,0.01,0.05,0.1,0.5,1ng/ml;ZEN剂量为0,2.5,5,7.5,10μg/ml)分别单独或联合(正交组合)染毒GT1-7细胞,经过3h和6h的培养后,用放射免疫法检测细胞培养液中的Gn RH浓度,同时,通过western blot检测Kisspeptins/GPR54信号通路上相关蛋白的表达情况,用SPSS17.0软件统计分析所得数据。制定检索策略,分析已有的文献证据,构建诱发CPP发生的AOP框架并对其进行评价。结果:通过拟合细胞的相对存活率曲线得出,IC50T-2为12.73ng/ml,IC50ZEN为30.67μg/ml,且T-2毒素的浓度在1ng/ml以下、ZEN的浓度在10μg/ml以下时,GT1-7细胞的相对存活率在80%以上,同时,采用Benchmark Dose法计算得出BMDL T-2为0.57ng/ml,BMDL ZEN为7.72μg/ml,因此,选用T-2毒素0,0.01,0.05,0.1,0.5,1ng/ml六个剂量和ZEN 0,2.5,5,7.5,10μg/ml五个剂量作为后续功能性研究的实验剂量。分别以含各浓度T-2毒素和ZEN的培养液单独染毒GT1-7细胞3h后,T-2毒素对GT1-7细胞分泌Gn RH的功能无显著影响,而ZEN单独染毒可促使GT1-7细胞分泌Gn RH的水平呈明显的剂量依赖性增高;二者分别单独染毒6h时,T-2毒素在0.05,0.1,0.5ng/ml、ZEN在2.5,5,7.5,10μg/ml的剂量可刺激GT1-7细胞分泌Gn RH的水平显著增高,并呈现出一定的剂量依赖性。选择ZEN对GT1-7细胞功能影响最显著的剂量与T-2毒素的各剂量组合,检测GT1-7细胞的相对存活率,通过拟合计算得出当ZEN的剂量为5μg/ml、T-2毒素的剂量为3.323ng/ml时,有50%的GT1-7细胞存活,当ZEN的剂量为5μg/ml、T-2毒素的剂量为1ng/ml时,GT1-7细胞有80%左右的存活,因此,选择ZEN为0,5μg/ml,T-2毒素为0,0.01,0.1,1ng/ml进行组合实验。结果得出,T-2毒素和ZEN联合暴露3h时,各染毒组的Gn RH水平均显著高于对照组,但ZEN与T-2毒素联合染毒的各组间无明显的统计学差异。而联合暴露6h时,各染毒组的Gn RH水平明显高于对照组,且ZEN与T-2毒素联合暴露的各组间,随着T-2毒素剂量的升高,Gn RH的水平有升高的趋势,但无统计学显著性。Western Blot方法检测Kisspeptins/GPR54信号通路相关蛋白(GPR54、PLC、PKC)的表达情况,分析得出各关键蛋白,尤其是GPR54的变化趋势与Gn RH的变化一致。以Kisspeptins/GPR54信号通路为促使CPP发生的早期分子事件,以性早熟的临床表现为最终的有害结局,系统整合青春期启动的现有数据资源,构建了诱发CPP发生的AOP工作框架如下图。结论:本研究通过评价T-2毒素和ZEN对下丘脑神经元GT1-7细胞分泌Gn RH的毒性效应得出,在一定剂量范围内的T-2毒素和ZEN单独或者联合暴露均可通过扰动Kisspeptins/GPR54信号通路刺激GT1-7细胞分泌Gn RH的水平增高,提示霉菌毒素单独或共存污染可能促进青春期提前启动,具有潜在的食品安全风险。同时,构建中枢性性早熟的AOP工作框架,为环境化学物导致中枢性性早熟潜在危害的风险评估提供高效的新策略和新思路。