【摘 要】
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纳豆激酶(Natto kinase，NK)是一种由纳豆菌或纳豆枯草杆菌产生的碱性丝氨酸蛋白酶，具有安全性好、成本低、纤溶活性强、可口服、作用时间长等优点，已成为研究血栓药物的新热点，有
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纳豆激酶(Natto kinase，NK)是一种由纳豆菌或纳豆枯草杆菌产生的碱性丝氨酸蛋白酶，具有安全性好、成本低、纤溶活性强、可口服、作用时间长等优点，已成为研究血栓药物的新热点，有望被开发为新一代用于血栓性疾病的预防和治疗的口服抗血栓药物。本研究旨在构建纳豆激酶在禽输卵管特异性表达的慢病毒载体，采用鸡输卵管上皮细胞和鸡胚成纤维细胞中进行外源基因特异表达研究。主要研究结果如下: 从鸡血中提取总基因组DNA，经PCR扩增，得到2.8kb的鸡卵清蛋白启动子(OV2)和666bp的雌激素反应元件(ERE)。将其连接在慢病毒表达载体pLV-eGFP上，并替换pLV-eGFP上原有的CMV启动子，经菌液PCR、酶切和测序鉴定获得了重组质粒pLV-OV2-ERE-eGFP。将大小为2077bp，经化学合成含纳豆激酶基因的NK-2A-eGFP基因片段插入质粒上pLV-OV2-ERE-eGFP，替换pLV-OV2-ERE-eGFP上原有的eGFP片段，经菌液PCR、酶切和测序鉴定获得了重组纳豆激酶慢病毒表达载体pLV-OV2-ERE-NK-2A-eGFP。 将纳豆激酶慢病毒表达载体pLV-OV2-ERE-NK-2A-eGFP经慢病毒包装后，分别转染鸡输卵管上皮细胞和鸡胚成纤维细胞进行表达。在荧光显微镜下观察，发现转染的输卵管上皮细胞48h后出现绿色荧光细胞，鸡输卵管上皮细胞转染效率约为10％，而成纤维细胞没有发现绿色荧光，表明卵清蛋白启动子在鸡输卵管上皮细胞具有一定表达特异性。通过实时荧光定量PCR，检测纳豆激酶在细胞中的mRNA表达水平。得出纳豆激酶慢病毒载体在鸡输卵管上皮细胞中的mRNA表达量较低，推测由于卵清蛋白启动子OV2的效率较低导致。本实验为进一步的转基因禽类制作奠定了基础。
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