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禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)是一种寄生在禽类肠道及黏膜表面、可引起局部或全身性感染的细菌性疾病,属于肠道外致病性大肠杆菌(Extraintestinal pathogenic coli,ExPEC),是禽大肠杆菌病的主要病原菌。APEC分布较广,给世界各地养禽业带来了较大经济损失,同时也给人类食品安全构成潜在威胁。目前,已知的APEC的毒力因子有黏附素、内毒素、外膜蛋白、铁摄取系统和Ⅲ型分泌系统等。外膜蛋白酶T(Outer membrane protease T,OmpT)多位于细菌表面,属于革兰氏阴性菌外膜蛋白酶家族。有研究表明OmpT在增强细菌表面的黏附和侵袭能力发挥作用,与APEC的致病性相关,并且具有良好的免疫原性,因此有一定的研究价值。APEC E058株的OmpT蛋白由位于染色质的compT基因和位于质粒中的pompT基因分别编码。本研究将课题组保存的重组表达菌株pET-28a-compT和pET-30a-pompT进行复苏并鉴定,经IPTG诱导表达的重组蛋白,再采用尿素梯度透析法进行复性。PCR结果显示,pET-28a-compT和pET-30a-pompT菌液扩增出的基因片段大小均为894 bp,与预期大小一致;SDS-PAGE电泳结果显示,两个重组蛋白均以包涵体的形式表达,cOmpT和pOmpT的蛋白分子量分别为36 kD和33.6 kD,与预期大小相符,且纯度较高。Western blot鉴定结果表明cOmpT的抗原性较好。将表达纯化后的cOmpT作为免疫原,接种至BALB/c小鼠体内。采用方阵滴定法,建立间接ELISA的检测方法,抗原最适包被浓度为0.625 μg/mL,血清最适稀释度为1:6400。四次免疫后采血,间接ELISA检测效价,取免疫小鼠脾细胞与鼠源骨髓瘤细胞(SP2/0)进行细胞融合。采用杂交瘤细胞技术和有限稀释法,多次筛选后得到3株能稳定分泌抗cOmpT蛋白的单克隆抗体,分别命名为1G8、2C3和2G3,杂交瘤细胞上清中抗体效价分别为 1:200、1:3200 和 1:3200。其中,2C3 和 2G3 的腹水效价分别为 1:512000、1:256000。单抗亚类鉴定结果显示,3株杂交瘤细胞株分泌的抗体均为IgG2b亚类。根据Western blot鉴定分析,制备的3株单克隆抗体与cOmpT蛋白均发生特异性反应,而不与其他受检菌发生交叉反应。为确定获得的单克隆抗体所针对的抗原表位,将去信号肽的compT基因作为模板,按照不同的细胞外环对应的氨基酸序列,分别设计引物进行PCR扩增,经酶切后再分别连接至原核表达载体pET-28a上,将鉴定正确的阳性菌株进行诱导表达。截短表达蛋白cOmpT A、cOmpTB、cOmpTC、cOmpTD和cOmpTE,经SDS-PAGE检测正确后,利用单克隆抗体1G8、2C3和2G3分别对表达产物进行Western blot分析。结果显示,1G8、2C3的抗原表位确定在cOmpT B上,2G3的抗原表位初步定位在cOmpT D。为了缩小抗原表位区域,对cOmpT B和cOmpT D截短表达,结果显示单抗1G8识别的抗原表位是83DQDWMDS89,单抗2C3识别的抗原表位是90SNPGTW95,单抗2G3识别的抗原表位是197TFKYSGW203。本研究成功制备了 3株抗cOmpT蛋白的单克隆抗体并对其识别的抗原表位进行了鉴定,为cOmpT蛋白功能研究和APEC新型表位疫苗研发奠定了基础。