1.研究背景2001年香港大学微生物学系Yuen等在一名肝硬化病人的胸腔脓液和血液中首次分离出香港海鸥形菌(Laribacter hongkongensis, LH)(菌株号HKU1),通过生化特性和16S rRNA基因序列等分析,发现此菌与其他属细菌有很大不同,属新发现细菌菌属。2004年6月香港大学医学院微生物学系Woo等发表在国际权威医学杂志《Lancet》上一项最新研究成果,研究通过一个多中心的病例对照研究提出香港海鸥形菌可能是导致胃肠炎尤其是较严重胃肠炎的原因之一,且食用淡水鱼与外出旅游是该类腹泻的主要危险因素,而后在香港市售约占四分之一淡水鱼(如草鱼、大头鳙鱼、鲮鱼和大嘴鲈鱼等)的肠道中分离到该菌。目前,我国内地对LH的研究还处于起步阶段,且主要集中在淡水鱼中该菌污染情况的调查,如广东省、广西省、浙江省和河北省等也不断有研究报道该菌在多种淡水鱼中被检出,而关于人群感染状况的研究近乎处于空白。迄今为止,仅有浙江省杭州市疾病预防控制中心倪晓平等从该市某医院2428例门诊腹泻病人中分离到13例LH的研究报告,尚未见其他人群带菌情况的研究。广东毗邻香港,自然生态和社会生态与香港相似,经贸往来频繁,又是香港淡水鱼的主要供应基地,且LH在淡水鱼的检出率高达41.7%。目前,为防止香港海鸥形菌感染类腹泻的发生,该菌已成为广东输往香港淡水鱼的必检致病菌之一。然而,广东尚未见人群感染的研究报道,该菌对人群健康和安全的潜在危险性尚不清楚,其病原学特征更是空白。所以,我们以广东省江门市为研究区域,对江门市感染性腹泻患者和某些淡水产品中香港海鸥形菌的携带情况进行了调查,并对阳性分离株进行了病原学分析。2.研究目的2.1了解江门市感染性腹泻患者和某些淡水产品中香港海鸥形菌的携带情况。2.2初步了解江门市人群和涉淡水产品香港海鸥形菌阳性分离株的病原学特性以及菌株间的亲缘关系。3.研究方法3.1标本的采集于2009年4-12月采集江门地区各级医院门诊腹泻患者肛拭子和涉淡水产品肠容物拭子进行LH检测。用自制调查表登记病人的本底资料、临床表现和流行病学调查资料3.2细菌培养分离鉴定方法所采集肛拭子立即放入Cary-blair氏运送培养基,48h内送到实验室进行细菌培养鉴定。肛拭子直接划线改良头孢哌酮MacConkey琼脂(CMA)平皿,头孢哌酮浓度为16 mg/L,同时加入浓度为1%的葡萄糖,CMA培养皿置37℃培养箱培养48小时。试验均以LHK1菌株(香港大学微生物学系袁国勇教授惠赠)作为阳性对照菌株。可疑细菌进行革兰染色,过氧化氢酶、氧化酶、脲酶和三糖铁等关键生化试验筛选,以上均符合者再采用API鉴定。3.3细菌16SrRNA基因PCR鉴定法16S rRNA基因保守区的扩增使用引物LPW264:5’-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’, LPW265:5’-GNTACCTGTTACGACTT-3’对水煮法提取的DNA模板进行扩增,目的片段长度约为1500bp。反应体系为50 u1,包括10×buffer(?)：内含Mg2+) 5ul,2 mmol/L dNTPs 4ul,5 U/ul的Taq DNA聚合酶1u1,引物各1 ul,模板DNA 2ul, ddH2O 36 ul;反应条件：预变性94℃5 min,后续94℃C30s,53℃C40s,72℃C40s,35个循环,72℃C延伸5min。在紫外线灯下观察琼脂糖凝胶电泳结果。PCR扩增产物送上海Invitrogen公司进行序列测定,序列结果用软件blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast)进行同源性比对。3.4纸片扩散法确定LH人源分离株的抗生素敏感性采用WHO推荐的K-B纸片扩散法测,判定标准按美国CLSI/NCCLSM100-519抗微生物药物敏感性试验执行标准(2009版)肠杆菌科抑制圈直径的解释标准执行。敏感(suseeptible, S)率、中介(intermediate, I)率、耐药(resistant, R)率分别用S%、I%、R%表示。并用大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923作质控。3.5建立(Pulsed Field Gel Eleetrophoresis, PFGE)分型技术对分离株进行PFGE分型；采用Bio Nujmericsv4.0软件中的非加权配对算数平均法(UPGMA)进行聚类分析,分析菌株的亲缘关系。4.研究结果4.1江门市人群现场本研究于2009年4-12月,对江门地区目标医院门诊腹泻患者肛拭子标本进行了检测。共采集肛拭子标本804份,2份标本中香港海鸥形菌检测呈阳性,经过生化鉴定和16S rRNA基因序列测定,并与GenBank中登录的香港海鸥型菌(菌株号HKU1)进行序列比对,其同源性均为99%,这是目前广东省社区获得性腹泻患者中首次发现的香港海鸥形菌感染病例。4.1.1菌落及菌体特征CMA培养基37℃培养48 h后,菌落呈灰白色、半透明、圆形、略凸起、直径在1.0-1.5mm之间、光滑、不粘连,略显湿润。革兰氏染色镜检为革兰氏阴性、形状呈螺旋杆状或展翅海鸥形状。4.1.3生化特征JM1和JM2的生化检测结果：均为革兰氏阴性菌,氧化酶、过氧化氢酶、脲酶、精氨酸双水解酶、硝酸盐还原酶、甘露醇、葡糖酸盐、癸酸盐等阳性,三糖铁阴性、色氨酸、葡萄糖酸化、七叶灵水解、明胶酶、p-半乳糖苷酶、阿拉伯糖、甘露糖、乙酰氨基葡萄糖、麦芽糖、已二酸、苹果酸盐、柠檬酸盐利用、乙酸苯酯、葡萄糖等阴性。4.1.4药敏结果JM1对头孢噻吩、头孢呋辛、头孢哌酮、头孢唑啉、头孢他啶、克林霉素、甲硝唑等表现出耐药性；对哌拉西林、胺苄西林等表现为中介；而对头孢吡肟、亚胺培南、氨曲南、三甲氧苄氨嘧啶、环丙沙星,庆大霉素以及丁胺卡那霉素、四环素等均为敏感。JM2除对哌拉西林、胺苄西林耐药,对四环素和甲硝唑表现为中介,余同JMl。4.2江门市部分淡水生物对广东省江门市生态环境中部分淡水生物携带“香港海鸥形菌”的情况进行了流行病学调查,共计检测标本425份,总检出率为5.9%(25/425)。4.2.1草鱼的检测：检测市售草鱼63条,香港海鸥型菌的阳性率为30.1%(19/63)。4.2.1福寿螺的检测：检测野生福寿螺265只,4只阳性,阳性率为1.51%(4/265),福寿螺中分离出香港海鸥型菌为本研究中首次发现,目前为止国内外文献未见有相关报道。4.2.3蛙类的检测：检测分离野生虎纹蛙5只、青蛙2只,其中该菌检测分离各有1只阳性,阳性率为28.6%。4.2.4其他：检测小猫鱼15只(捕获于乡间小溪)、河蚌10只、白蚬23只、石螺42只、武昌鱼18条均未检出香港海鸥型菌。4.3 LH分离株PFGE分子分型的结果4.3.1 LH分离株PFGE方法的建立及条件优化本研究PFGE方法的实验技术条件为：OD值为5.0,细胞裂解时间为8h,酶切条件为SPeI 20U酶切6 h,电泳脉冲时间为2.16-63.80s,脉冲角度为120°,电场强度为6V/cm,电泳20 h。结果可见清晰的酶切条带,图像位于正中,在没有图像分析软件的情况下,肉眼也可进行判断。证实所建方法可行,条件适合。4.3.2 LH分离菌株的PFGE分型结果在使用相同的试剂、仪器和参数的前提下,27株菌经限制性内切酶SpeI酶切后进行PFGE电泳,每株约出现10-14个电泳条带,分子量在30kb-700kb之间。经Bionumerics V4.0软件进行聚类分析,相似值在46.6%-100%之间,可分为23个型(相似值为100%视为同一PFGE型别)。其中鱼源株Y16与Y25,Y28与Y29,Y35与Y39和蛙源株W2与W8的相似度分别为100%。5结论在江门市腹泻病人分离到香港海鸥形菌,尽管分离率不高,但也可提示该菌可能导致人腹泻。在多种淡水产品中分离到香港海鸥形菌,其中蛙源株和鱼源株检出率明显高于其他物种的检出率,PFGE分型结果显示27株菌株被分为23型,菌株的异质性较高,其中4个基因型聚集着少量菌株,鱼源株Y16与Y25,Y28与Y29,Y35与Y39和蛙源株W2与W8的相似度分别为100%,具有相同的基因型的菌株基本上从同一个采样季节及品种的水产品中分离得到,提示该市LH非人源株具有物种聚集性和区域聚集性,这一点应给予关注。