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性别控制技术对于加快优良母畜的繁殖速度,提高限性性状畜牧业的生产效益有重要意义,而早期胚胎性别鉴定是进行性别控制的一种重要方法。在XY型性别决定的哺乳动物中,Y染色体决定雄性性别,如果可以标记Y染色体,区分雌雄性别就会变得轻而易举。本研究的目的是通过基因编辑的手段进行Y染色体标记,建立一种无损伤快速鉴定哺乳动物早期胚胎性别的方法,为哺乳动物性别控制的研究提供一种新的思路。基于此,本研究进行了如下尝试:首先对CRISPR/Cas9系统介导的外源基因整合效率进行优化;基于优化的条件以小鼠为研究模型,采用CRISPR/Cas9系统介导的同源重组技术获得Y染色体上插入e GFP基因的转基因雄性小鼠系,e GFP基因就可以随着Y染色体的分离传递到雄性后代的基因组中,绿色荧光蛋白(GFP)的表达可以直观地指示早期胚胎和后代的性别。为了拓展该方法在农业生产上的应用,本研究通过CRISPR/Cas9系统介导的HDR对巴马猪的肾脏成纤维(PKF)和水牛胎儿成纤维(BFF)细胞进行基因编辑,分别获得Y染色体上整合e GFP基因的成纤维细胞系,通过体细胞克隆成功生产出基因型为Y-Chr-e GFP的转基因克隆胚胎。主要开展的工作和研究结果简述如下:1.CRISPR/Cas9系统介导的外源基因整合效率的优化为了提高HDR的效率,本章针对Tubb3和Actb两个靶位点分别构建了三种不同长度的模板载体,然后在小鼠细胞系中进行优化,结果发现模板载体的同源臂越长,同源重组效率越高。本研究也比较了BFF细胞中同源臂长度分别为300 bp,800 bp和1200 bp的模板载体的HDR效率,结果表明同源臂长度为1200 bp的模板载体的HDR效率更高。通过在BFF细胞中添加P53蛋白的小分子抑制剂Pifithrin-μ(PFT-μ)发现,PFT-μ可以显著提高BFF细胞Actb位点的HDR效率。另外,本研究对比HMEJ(homology mediated end joining,HMEJ)和HDR两种不同的外源基因整合机制介导的基因敲入效率发现,HMEJ介导的外源基因整合效率高于HDR,但差异并不显著(P>0.05)。2.应用CRISPR/Cas9系统介导的Y染色体标记进行小鼠植入前胚胎性别鉴定的研究本章以小鼠为研究对象,通过受精卵胞质注射和胚胎移植获得小鼠Y染色体Uty和Ddx3y基因间隔区导入e GFP基因的Y-Chr-e GFP转基因雄性小鼠系。将转基因雄鼠与野生型雌鼠交配,所获胚胎中表达绿色荧光蛋白的均为雄性,反之为雌性。将所有胚胎单个收集,巢式PCR确定胚胎性别发现,直观地通过荧光鉴定胚胎性别与PCR鉴定的结果完全一致。另外,分别统计Y-Chr-e GFP转基因小鼠与非转基因小鼠后代的性别比例,结果并没有显著差异。3.应用CRISPR/Cas9系统介导的HDR技术生产巴马猪Y-Chr-e GFP转基因克隆胚胎的研究首先,本章通过CRISPR/Cas9系统介导的HDR技术制备Y染色体上导入e GFP基因的Y-Chr-e GFP转基因巴马猪PKF细胞系,并验证外源基因整合位点的准确性。然后对比Y-Chr-e GFP转基因PKF细胞与非转基因细胞的生长特性,结果发现转基因细胞的生长速度和细胞活性均低于非转基因细胞。最后进行体细胞核移植,成功获得了基因型为Y-Chr-e GFP巴马猪转基因克隆胚胎。4.Y-Chr-e GFP转基因水牛胎儿成纤维细胞的生长、增殖、表观遗传相关基因的表达及克隆胚胎的生产首先,本章通过CRISPR/Cas9系统介导的HDR技术制备Y染色体导入e GFP基因的BFF细胞系,并验证外源基因整合位点的准确性。然后分析细胞的生长特性,发现Y-Chr-e GFP转基因细胞的增殖速度和细胞活性均低于非转基因细胞;实时荧光定量PCR的结果显示,转基因细胞中DNA甲基化相关基因DNMT1和DNMT3a的表达无显著变化,而组蛋白去乙酰化酶基因HDAC1,HDAC2,HDAC3的表达则显著升高;最后进行体细胞核移植,结果发现Y-Chr-e GFP转基因克隆胚胎的分裂率显著低于非转基因克隆胚胎,但囊胚率并没有显著变化。总之,本研究应用CRISPR/Cas9介导的Y染色体标记的方法成功进行了小鼠早期胚胎的性别鉴定,为哺乳动物早期胚胎性别鉴定提供了一种快速且无损伤的鉴定方法。此外,本研究也获得了Y染色体标记的猪和水牛的转基因克隆胚胎,为大动物性别控制的研究提供了新的思路与方法,同时也为体细胞克隆介导的基因修饰技术进行转基因大动物的生产奠定了重要的研究基础。