甘肃甘草内生菌有效菌种的筛选及药效学研究

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目的:通过对甘肃野生及栽培甘草内生菌多样性的研究,筛选出对金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌有抑菌作用的活性内生菌,考察活性内生菌的生理特性及成分,并以活性内生菌代谢产物与宿主植物有效成分进行小鼠肺炎药效学对比研究,观察甘草内生菌代谢产物与宿主有效成分之间的相关性,为解决甘肃野生甘草资源的匮乏和寻找甘草有效成分替代品提供实验依据。  方法:1、采用NA、PDA培养基对甘草内生菌进行分离和纯化,通过分离频率的比较寻找野生及栽培甘草各自的优势菌株。  2、以金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌为靶标菌,采用定性和定量两种抑菌方法,筛选出具有抑菌效果的活性内生菌。  3、通过测定活性内生菌的生长曲线、pH值范围等等,研究活性内生菌的生理特性。  4、利用HPLC法分析活性内生菌的代谢产物,计算目标成分的含量,掌握活性内生菌代谢产物的成分分布情况。  5、通过肺指数、NOS含量、IL-6含量、病理切片等指标的观察分析,研究活性内生菌代谢产物对小鼠肺炎的干预作用。  结果:1、野生及栽培甘草中共分离到132株内生菌,其中内生细菌119株,内生真菌13株,优势菌株为JTYB-001、JTYB-026、JTYB-060、JTYF-001、JTYF-006、JTZB-001、JTZB-049、JTZF-001。  2、野生及栽培甘草中筛选出的菌株JTYB-001、JTYB-053、JTZB-001对金黄色葡萄球菌均有抑制作用(P<0.05),JTYB-001、JTZB-001对肺炎链球菌也有抑制作用(P<0.05)。菌株JTYB-001和JTZB-001在MIC为2mg·ml-1的条件下能抑制金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的生长,菌株JTYB-053在MIC为1mg·ml-1的条件下能抑制金黄色葡萄球菌的生长。  3、菌株JTYB-001在4~10h生长速度最快,至24h仍在缓慢生长。菌株JTYB-053在4~16h生长速度最快,在16h达到最大值,此后进入衰亡期。菌株JTZB-001在4~10h生长速度最快,至24h仍在缓慢生长。  菌株JTYB-001、JTZB-001在pH值4-6时生长旺盛,pH值6-8时生长达到平衡,随着pH值的继续增大,其菌体生长呈下降趋势。菌株JTYB-053在 pH值<5时表现为弱生长,在 pH值5-6之间菌体生长旺盛,当pH值6-8时,菌体生长达到平衡,pH值>8时菌体生长呈下降趋势。  4、菌株JTYB-001、JTYB-053、JTZB-001的RT值与甘草酸标准品RT值接近,判断可能三种菌株的发酵液中含有甘草酸,经面积法计算三种菌株的甘草酸含量分别为0.033mg·ml-1,0.005mg·ml-1,0.013mg·ml-1。  5、菌株 JTYB-001、JTYB-053、JTZB-001均能降低小鼠肺指数(P<0.05),肺组织中的NOS含量(P<0.05)和血清中的IL-6含量(P<0.05),病理切片显示三株菌代谢产物能够减轻肺部的炎症反应。  结论:通过对甘肃甘草内生菌的分离培养及多样性研究,对金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的抑制作用研究,具有抑菌活性的内生菌株的生理特性测定,有效菌株次生代谢产物的成分分析,有效菌株对小鼠肺炎药效学研究,初步确定从甘草内生菌中能够产生有类似甘草有效成分如甘草酸样的物质,其能有效改变肺炎小鼠的病理变化,与宿主植物有效成分具有相类同的药理活性,但野生与栽培品间内生菌代谢产物的药理作用没有显著性差异。
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