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油菜是自然界中重要的产油作物,是生物油供应的三大作物之一,也是生物燃料的主要原料。油籽作物中的种子重量、种子大小和种子的含油量是育种者的主要选择特征。油菜生长发育所需的营养物质主要来自于油菜叶片和角果的光合作用,光合作用对油菜的产量和油籽的含油量有着至关重要的作用。本课题组前期对水稻研究中得到一个高光效调控基因NRPC1(negative regulator of photosynthesis and chloroplast development1),该基因敲除突变体的叶和穗都有深绿色表型,光合作用增强;通过同源比对在拟南芥中扩增到了NRPC1同源基因At NRPC1,其敲除突变体的叶和绿色角果都表现出深绿表型,光合作用也增强,研究表明该基因与调控叶绿体发育和叶绿素合成的关键转录因子GLK(GOLDEN2-LIKE)相互作用,并且负调控GLK基因的表达。基于以上对该基因功能研究的基础,通过AtNRPC1同源比对,在油菜中克隆得到6个BnNRPCs同源基因,并对BnNRPCs进行敲除,通过大量种植和一系列测序筛选最终鉴定到了BnNRPC1/2/3/4四突突变体和BnNRPC5/6双突突变体作为本实验的材料。论文分析了BnNRPCs基因家族在油菜叶绿素合成、光合作用中的生物学功能。本实验的主要研究结果如下所述:第一,利用酵母双杂(Y2H),证明油菜BnNRPC1,BnNRPC2,BnNRPC3,BnNRPC4,BnNRPC5,BnNRPC6蛋白都可以与BnGLK1相互作用。组织特异性表达结果表明,BnNRPC1/2和BnNRPC3/4主要在叶片和绿色角果中表达;而NRPC5/6在根和花中表达水平远远高于其他组织。第二,构建BnNRPC1/2/3/4基因和BnNRPC5/6基因的CRISPR/Cas9敲除载体,通过农杆菌介导的油菜遗传转化技术将转基因载体转化到野生甘蓝型油菜中,成功的获得了bnnrpc1/2/3/4四突突变体和bnnrpc5/6双突突变体。通过表型比对,结果表明突变体的叶片呈现深绿的表型,其中bnnrpc1/2/3/4四突突变体叶片颜色更绿,叶绿素含量比野生型增加了约15%,角果不仅深绿而且更大,角果叶绿素含量比野生型提高了60%。第三,将WT、bnnrpc1/2/3/4四突突变体和bnnrpc5/6双突突变体作为一个系列,测定其叶绿素含量、光合相关参数。结果表明,相比于WT,bnnrpc1/2/3/4四突突变体和bnnrpc5/6双突突变体叶片和角果中叶绿素含量显著升高,并且净光合速率(Pn),气孔导度(gsw)和蒸腾速率(Tr)明显升高,光合效率增强,其中四突突变体和双突突变体的光合作用分别比WT增强了约14%和11%。初步统计了bnnrpc1/2/3/4突变体和bnnrpc5/6突变体的千粒重分别比WT增加了11.6%和5%,在大田中进一步统计发现bnnrpc1/2/3/4突变体的每角果粒数比野生型高12.3%,而bnnrpc5/6并没有明显增加。bnnrpc1/2/3/4突变体和bnnrpc5/6的千粒重分别比野生型高18.5%和6%。总而言之,油菜BnNRPCs基因家族通过BnNRPCs-GLK途径负调控叶绿素合成与光合效率。本文研究BnNRPCs的生物学功能,阐述BnNRPCs-GLK调控油菜光合效能的分子机理。通过基因编辑技术获得油菜bnnrpc1/2/3/4四突突变体和bnnrpc5/6双突突变体材料,为油菜高光效研究以及高产分子育种利用提供了理论支撑的同时,展现了BnNRPCs在重要油料作物油菜中美好的应用前景。