前言：　　 经皮冠状动脉介入治疗术(percutaneous coronary intervention,PCI)是目前治疗冠心病的重要手段之一,但PCI术后再狭窄(Restenosis,RS)的发生严重影响了远期疗效。再狭窄的发生是机体对血管内皮损伤的一种修复反应,包括早期的血管弹性回缩和后期的血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecell,VSMC)增生、迁移,细胞外基质的产生以及血管重塑等。以药物洗脱支架为代表的新医疗器械的应用,显著降低了PCI术后再狭窄的发病率。然而其远期疗效还有待考证。近年来随着分子生物学的发展,基因治疗很可能成为防治PCI术后RS的一种新策略。早期生长反应因子-1(early growth response factor-1,Egr-1)是一种锌指结构转录因子(transcriptionfactor,TF),它控制与细胞生长、增殖、分化和凋亡相关的多个基因的表达,在外源性刺激(包括生长因子、细胞因子和有害刺激)下被激活,诱导VSMC的分裂、增殖和内膜增生。脱氧核酶(deoxy riibo zyme,DRz)是一个具有酶活性的小的单链DNA片段,通过切割特定的RNA链调节蛋白的表达,作为一种基因抑制剂有着实际的治疗作用。本研究应用合成的Egr-1特异脱氧核醇(DNAenzyme/10-23DRz,ED5)转染至球囊损伤后的大鼠颈总动脉中,观察其对大鼠颈总动脉球囊损伤后内膜增生的影响,评估转染ED5后对生长因子、细胞周期和炎症基因表达变化的影响,探讨其在血管损伤后抑制内膜增生的作用机制。　　 材料和方法：　　 1、ED5的合成与标记　　 根据基因库合成ED5(由上海博亚生物技术有限公司合成),其碱基序列为5-CCGCGGCCAGGCTAGCTACAACGACCTGGAC-GAT-3,在其5和3端进行硫代修饰,5端用异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)标记,以便于在荧光显微镜下观察转染后基因的分布情况。两侧下划线所示部分为寡核苷酸识别序列。　　 2、动物模型制备和实验分组　　 96只雄性Wistar大鼠(350-400克)由中国医科大学实验动物中心提供。所有动物均根据实验室动物护理的原则以及中国动物保护法处理。随机分为4组(每组24只):假手术组,MgCl2组,FuGene6组和FuGene6+ED5治疗组。在左颈总动脉造成内膜撕脱和血管损伤。具体过程为:10%的水合氯醛麻醉后,颈正中切开,暴露左颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉,用血管夹暂时阻断左颈总动脉和颈内动脉,用2F导管(美国BxaetrHealthcarecorporalion)从颈外动脉插入向前推进至主动脉弓,推入生理盐水充盈气囊,沿颈总动脉全长回撤,然后抽瘪气囊。这个过程重复三次,且每次回撤时导管旋转90度。撤除导管后将200ul含有500μgFITC-ED5、转染试剂30μlFuGene6(购自Roche公司)和170μl1mMMgCl2的溶液局部注入至损伤的血管节段内,使其在局部作用20分钟。结扎颈外动脉,移除颈总动脉和颈内动脉的血管夹恢复血流,缝合伤口。术后局部使用青霉素以预防感染,术后3、7、14、21d分批处死动物。　　 3、形态分析　　 HE染色用于形态学测量。颈总动脉用石蜡包埋,然后切成5μm厚的切片,并用HE染色,结果用电脑辅助形态分析系统分析,特别注意分析内膜和中膜的厚度。测量外弹力层包绕的面积(EELA),内弹力层包绕的面积(IELA)和管腔面积(LA)用来评估新生内膜的厚度。其他面积计算如下:中膜面积=EELA-IELA,新生内膜面积=IELA-LA,内膜中膜面积比(I/M)=新生内膜面积/中膜面积。　　 4、免疫组化　　 标本用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,然后制备成5μm厚的切片。然后用二甲苯和乙醇脱蜡。切片在3%H2O2孵育10min用来灭活内源性酶的活性。然后切片在牛血清蛋白(BSA)中孵育20min以尽量减少非特异性结合的抗体。分别加入稀释至1:200的一抗(Egr-1、PDGF-BB,CyclinD1,CDK4,MCP-1和ICAM-1),4℃过夜。PBS冲洗三遍后,切片滴加生物素标记的二抗,在常温下孵育30min。三遍冲洗后,滴加抗生物素蛋白—生物素—辣根过氧化酶复合物,常温下孵育30min,之后用PBS清洗,在显微镜直视下用DAB显色,苏木素复染。棕褐色用来表示阳性染色。PBS代替一抗做为阴性对照。　　 5、实时PCR分析　　 按照制造商的说明(Invitrogen,生命科技,美国)应用TRIZOL试剂从颈总动脉提取总RNA。RNA浓度用分光光度计测量(UV300,Hamp-shire,England),cDNA用反转录酶合成。使用ABI7500Prism序列检测系统和TaqMan引物探针完成实时PCR的操作。总反应体积为20μ1:2μl的cDNA,10μl的SYBR(R)PremixExTaqTM,0.4μl的引物和7.2μl的超纯水。主要的循环参数如下:1个循环的预变性(95℃30s),40个循环的退火(95℃5s)和延伸(60℃34s)。Β-actin作为每个样品的内参。2-△△Ct方法计算基因表达的相对变化。　　 6、Westernblot分析　　 含有50μg总蛋白的样品用SDSPAGE分离,并转移到PVDF膜上。脱脂奶粉封闭过夜,用TBS液清洗两遍,然后加入1:400稀释的一抗(Egr-1、PDGF-BB,CvclinD1,CDK4,MCP-1和ICAM-1)中室温下孵育2小时。辣根过氧化物酶标记一抗,化学发光试剂增强反应。　　 7、统计分析　　 所有的测量数据用均数士标准差表示,使用SPSS13.0软件进行统计分析。用单因素方差分析进行数据分析,组间比较采用LSD法,当P＜0.05,结果被认为具有统计学意义。　　 实验结果：　　 1、在体转染效率　　 转染ED524小时或7天后,收集血管标本,然后在470-490nm的荧光显微镜下观察,以确定转染效率。转染ED5基因24小时后,可见血管内膜和中膜有大量绿色荧光分布,证明转染成功。转染后7天,在血管内膜和中膜仍有较强的分布。　　 2、血管病理形态学改变　　 光镜下可见:假手术组大鼠颈总动脉内膜完整;血管损伤后7d,MgCl2组和FuGene6组血管内膜开始增生,管腔轻度狭窄,而治疗组则不明显;损伤后14及21d,MCl2组和FuGene6组血管内膜明显增生,管腔明显狭窄;ED5治疗后内膜增生明显减轻,管腔增加(P＜0.01)。　　 3、免疫组织化学结果　　 假手术组动脉无Egr-1,PDGF-BB,CyclinD1,CDK4,MCP-1和ICAM-1的表达,球囊损伤后3、7、14、21天在中膜和增生的内膜有明显的免疫反应。球囊损伤后Egr-1和PDGF-BB在血管平滑肌细胞胞浆的表达随着时间的推移上调,Egr-1的表达高峰在21天,PDGF-BB的高峰在14天。细胞周期相关蛋白CyclinD1和CDK4的表达在新生内膜血管平滑肌细胞的细胞核,高峰出现在7天。损伤后7天,炎症相关蛋白-ICAM-1在新生内膜的血管平滑肌细胞和再生的内皮细胞的表达显著。MCP-1,另一个炎症相关蛋白,损伤后3天在中膜的表达显著增加,随着时间的推移逐渐下降。与MgCl2组和FuGene6处理组比较,ED5治疗组的染色明显减轻。　　 4、RealtimeRT-PCR结果　　 在假手术组血管组织,Egr-1,PDGF-BB,CyclinD1,CDK4,MCP-1和ICAM-1的表达微弱。球囊损伤后,Egr-1,PDGF-BB,CyclinD1,CDK4,MCP-1的ICAM-1mRNA的表达明显增加。Egr-1mRNA的表达随着时间的推移逐渐增加,MCP-1mRNA的表达高峰在3天,ICAM-1,CyclinD1和CDK4mRNA的高峰在7天,PDGF-BB的高峰出现在14天。ED5治疗后,Egr-1,PDGF-BB,CyclinD1,CDK4,MCP-1和ICAM-1mRNA的表达在每个时间点相对于MgCl2组和FuGene6组均显著下降。　　 5、Westernblot结果　　 假手术组Egr-1,PDGF-BB,CyclinD1,CDK4,MCP-1和ICAM-1的蛋白表达非常低或没有表达。球囊损伤后Egr-1,PDGF-BB,CyclinD1,CDK4,MCP-1和ICAM-1的蛋白表达同其mRNA的表达类似。MCP-1免疫印迹带的最强度为3天,CyclinD1,CDK4和ICAM-1免疫印迹带的最强度为7天,PDGF-BB为14天,而Egr-1为21天。ED5治疗组,上述基因的条带强度与单纯损伤组和FuGene6组相比显著减弱。　　 结论：　　 ED5转染可以抑制大鼠动脉损伤后内膜的增生,其机制可能是通过特异地抑制Egr-1及其相关基因(如PDGF-BB,CyclinD1,CDK4,MCP-1和ICAM-1)等的表达而实现的。