背景间质性肺病(interstitial lung disease，ILD或DILD，diffuse interstitiallung disease)是以弥漫性肺实质、肺泡炎症和间质纤维化为基本病理病变，以活动性呼吸困难、X线胸片弥漫性浸润阴影、限制性通气障碍、弥散功能(肺一氧化碳弥散量，DLCO)降低和低氧血症为临床表现的一类疾病。ILD中一部分患者继发于类风湿关节炎、系统性硬化症、系统性红斑狼疮、多肌炎/皮肌炎、强直性脊柱炎及混合结缔组织病，临床上也很常见。间质纤维化一旦形成，将不可逆地导致严重的甚至威胁生命的呼吸循环功能障碍。因此，加深对肺间质纤维化机制，尤其是对其病程早期阶段的认识，是该病发病机制和治疗研究亟待解决的问题。CD147，又称为细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（extracellular matrixmetaloproteinase inducer，EMMPRIN），属于免疫球蛋白超家族，在体内广泛表达。Cyclophilin A（CyPA）是存在于多种细胞内的细胞溶质蛋白，CD147的配体，环孢素A（cyclosporine A，CsA）作用的靶分子。CsA是一种强效的免疫抑制剂，特异作用于淋巴细胞，临床用于预防和治疗同种异体器官移植或骨髓移植的排斥反应或移植物抗宿主反应，也用于经其他免疫抑制剂治疗无效的狼疮肾炎、难治性肾病综合征等自身免疫性疾病。本研究所以往研究报道，在炎症病灶中高表达CD147分子的配体CyPA可趋化炎细胞在关节病灶中聚集，通过与CD147相互作用在RA关节内、外病变的发生与发展中发挥重要作用，CsA对上述病理过程有抑制作用。为了探明CyPA-CD147在肺间质性病变中是否也存在相似的作用和机制，本实验在前期工作的基础上，建立肺间质纤维化小鼠模型，研究其病程中的细胞与分子基础，并用CsA进行早期干预治疗，初步探讨CD147-CyPA在肺间质纤维化发病中的作用。目的建立肺间质纤维化小鼠模型，观察模型小鼠肺部炎性细胞浸润及胶原纤维沉积的病理过程，探索其细胞与分子基础。用CsA治疗模型小鼠肺间质炎症及纤维化，探讨其可能的机制。方法和结果1肺间质纤维化小鼠模型及研究体系的建立1.1肺间质纤维化小鼠模型的建立雌性，9～11周龄C57BL/6小鼠按照随机数字表分为3组：模型组（BLM组）、盐水对照组（saline组）和空白对照组（NC组），每组各24只。以5.0mg/kg（浓度2.0mg/ml）建立肺间质纤维化小鼠模型，saline组在相同条件下向气管内注入同体积生理盐水。1.2检测及研究于给药第4d、7d、14d分批取材，每次每组8只。实验小鼠均经眼球取血法取外周血500μL，肝素钠抗凝。计数白细胞总数，流式细胞术检测CD4~+T淋巴细胞、CD14~+单核细胞和CD19~+B淋巴细胞数量比例。剪取小鼠左上肺组织块置100mL/L福尔马林固定24h，经脱水、石蜡包埋后，制作石蜡切片（切片厚度3μm），行HE及Masson染色。采用Ashcroft评分标准评价BLM组小鼠肺组织纤维化情况。细胞计数板计数BALF细胞总数，细胞涂片行Giemsa染色。1.3结果1.3.1外周血及BALF细胞分析BLM组小鼠外周血白细胞总数明显升高，在造模后第7d达高峰，为（10.96±0.35）×10~9/L，显著高于同一时间点saline组（P<0.01）。流式细胞术检测发现CD14~+单核细胞在第4~14d的比例均数分别为5.94%、5.86%、4.76%，均较saline组显著增高。CD19~+B淋巴细胞仅在造模第7d、14d较saline组升高明显。各时间点NC组与saline组白细胞计数、CD14~+单核细胞及CD19~+B淋巴细胞相比均未见显著差异。BLM组第4~14d时BALF细胞总数分别为（35.2±10.10）×10~6/肺、（23.1±15.52）×10~6/肺和（14.89±1.33）×10~6/肺，均较同一时间点saline组显著升高。细胞分类计数显示，BLM组BALF中升高的主要为淋巴细胞（7d：104.90/HP），至14d时仍维持在较高水平。其次为单核-巨噬细胞，中性粒细胞在早期（4d，7d）升高明显。各时间点NC组与saline组BALF细胞计数、单核-巨噬细胞、淋巴细胞及中性粒细胞相比均未见显著差异。1.3.2肺组织病理观察肺组织病理观察显示，BLM组自实验第4d开始肺泡间隔逐渐增宽，间质内细胞浸润逐渐增多，以淋巴细胞为主，并有单核-巨噬细胞及中性粒细胞的浸润。间质内及小支气管周围成纤维细胞自实验第7d开始聚集逐渐增多，胶原纤维沉积增多，第14d时见肺组织结构破坏，瘢痕形成。纤维化评分在第4d时平均为1.5分，随着时间延长而增加，至第14d时为6.92分，纤维化明显。Saline组及NC组各时间点肺组织均未见明显炎症及纤维化改变。2环孢素A治疗博来霉素诱导小鼠肺间质纤维化的研究2.1肺间质纤维化小鼠模型的建立及治疗雌性，9～11周龄C57BL/6小鼠按照随机数字表分为4组：CsA30mg治疗组、CsA50mg治疗组、治疗对照组（BLM+saline组）和BLM组，每组各24只。以5.0mg/kg（浓度2.0mg/ml）建立肺间质纤维化小鼠模型。于造模次日起腹腔注射给药，治疗组用CsA（30mg/kg，50mg/kg），溶于0.15ml生理盐水中，治疗对照组用同体积的生理盐水，每日1次。BLM组不予处理。2.2检测及研究于连续给药第4d、7d、14d分批取材，每次每组8只。实验小鼠均经眼球取血法取外周血500μL，肝素钠抗凝。计数白细胞总数，流式检测CD4~+T淋巴细胞、CD14~+单核细胞和CD19~+B淋巴细胞比例。剪取小鼠左上肺组织块置100mL/L福尔马林固定24h，经脱水、石蜡包埋后，制作石蜡切片（切片厚度3μm），行HE及Masson染色。免疫组化检测CD147表达情况。采用Ashcroft评分标准评价BLM组小鼠肺组织纤维化情况。细胞计数板计数BALF细胞总数，细胞涂片Giemsa染色。2.3结果2.3.1外周血及BALF细胞分析CsA治疗后，实验小鼠外周血白细胞总数在CsA30mg组为（5.11±0.25）×10~9/L，CsA50mg组为(5.63±0.34)×10~9/L，较BLM组（7.07±0.51）×10~9/L明显降低（P＜0.01）；CsA治疗组各时间点CD14~+单核细胞百分率均数显著降低，以4d时最为明显（＜3.2%）；CD19~+B淋巴细胞比例在4d时变化不明显，7d、14d时其百分率均数分别为39.95%和37.22%，均显著低于同一时间点BLM组（53.27%，P＜0.01）。各时间点BLM组和治疗对照组白细胞计数、CD14~+单核细胞及CD19~+B淋巴细胞百分率均数相比均未见明显差异。CsA治疗组小鼠BALF总数在用药初期即明显减少，4d时30mg组BALF细胞总数为（4.47±0.88）×10~5/肺，50mg组为（14.67±0.26）×10~5/肺，较之BLM组(35.20±1.10)×10~6/肺显著降低（P＜0.01）；CsA治疗组各型细胞数量亦明显下降，其中淋巴细胞下降最为明显，每高倍镜视野可见（16.56±6.44，25.29±14.16；vs BLM，P＜0.01），并持续低水平至第14d（17.44±8.34；10.58±3.61），病变明显改善。各组间中性粒细胞的比较在早期（7d、14d）有显著统计学差异。各时间点BLM组和治疗对照组BALF细胞计数、淋巴细胞、单核-巨噬细胞及中性粒细胞相比均未见显著差异。2.3.2肺组织病理观察CsA治疗组肺间质炎症明显减轻，且50mg组治疗效果明显好于30mg组，间质内及小支气管周围未见成纤维细胞明显聚集及胶原纤维沉积增多。纤维化评分均小于2.0，提示肺部纤维化情况改善。治疗对照组肺部可见明显炎症及纤维化改变，与BLM组相比无显著差异。2.3.3肺组织CD147的表达BLM组小鼠肺组织内浸润的单核-巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞均高表达CD147分子，CsA治疗组肺内表达CD147的细胞明显减少，但两剂量组间未见明显差异。结论本文成功建立了肺间质纤维化小鼠模型及其研究体系，并用CsA进行治疗研究。证明博来霉素诱导的肺间质纤维化发病早期表现为全身和肺部大量炎性细胞聚集，启动了炎症反应，随着疾病发展，将导致晚期肺损伤和纤维化的发生。CsA早期应用不仅可抑制炎症，而且可抑制疾病发展，其可能的机制是通过阻断CD147-CyPA相互作用，减少淋巴细胞、中性粒细胞及单核-巨噬细胞向肺内的趋化聚集及其炎症反应。所建立的研究体系和实验结果为深入研究提供了基础和条件。