河北香菊是我省农林科学院药用植物研究所自主研究培育的药食两用菊花新品种,是目前国内唯一的浓香型菊花,其总黄酮含量高达5.1%,明显高于其他同类品种。本室对河北香菊总黄酮部位进行的动物实验研究表明其具有较好的抗氧化活性,因此本文进一步从三个方面系统研究河北香菊中的五个黄酮及其苷类成分(木犀草素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素、金合欢素、金合欢素-7-O-β-D-葡萄糖苷)的抗氧化活性并进行了构效关系初探。第一部分河北香菊中黄酮类化合物对谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)活性的影响目的:研究河北香菊中五种黄酮类化合物对谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性的影响。方法:以谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒法测定黄酮类化合物对大鼠肝匀浆、全血及血浆中谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响;用钼酸铵显色法测定大鼠肝匀浆中过氧化氢酶活性的变化。结果:1.1大鼠肝匀浆中加入不同浓度的木犀草素、木犀草苷、芹菜素、金合欢素、金合欢苷温育1h后,大鼠肝匀浆中GSH-Px酶活力和CAT酶活力相对于对照组均有显著提高。加入最大浓度的药物后,木犀草素、木犀草苷、芹菜素、金合欢素、金合欢苷的GSH-Px酶活力分别提高到181.20±4.05、190.73±2.06、192.54±1.62、200.33±3.16、169.23±1.14酶活力单位;CAT酶活力达到314.63±1.20、290.43±2.81、314.88±2.66、291.02±2.68、268.37±3.65酶活力单位。1.2全血及血浆中加入不同浓度的五种黄酮类化合物温育1h后的, GSH-Px活力与对照组相比,均有显著增强,也呈现出明显的剂量效应关系。当木犀草素、木犀草苷、芹菜素、金合欢素、金合欢苷达到最大浓度时,大鼠全血中GSH-Px酶活力分别达到85.14±0.28、85.63±3.02、79.80±1.00、75.72±3.00、78.99±1.38酶活力单位,均高于其相应的对照组的活性(68.01±3.24、71.72±2.91、66.27±2.19、64.86±2.80、69.55±0.97酶活力单位)。而大鼠血浆中GSH-Px酶活力在加入最大浓度的木犀草素、木犀草苷、芹菜素、金合欢素、金合欢苷时,分别由对照组的887.46±3.07、877.51±4.66、862.01±1.69、873.32±2.57、814.82±2.66酶活力单位提高到952.78±2.68、937.75±7.36、900.08±3.98、895.97±2.92、835.57±4.29酶活力单位。1.3四组实验中各化合物在不同浓度组别之间的酶活力均有显著差别,呈现一定的剂量效应关系。且提高酶活力的能力顺序为:木犀草素>木犀草苷>芹菜素>金合欢素>金合欢苷。第二部分河北香菊中黄酮类化合物抗脂质过氧化活性研究目的:研究河北香菊中五种黄酮类化合物对脂质过氧化反应的抑制作用。方法:采用Ferric thiocyanate method (FTC法)测定五种化合物的总抗过氧化能力;用硫代巴比妥酸法测定五种化合物对H2O2诱导的大鼠肝匀浆及脑匀浆脂质过氧化反应的抑制作用;以H2O2诱导的大鼠红细胞溶血为模型,测定五种化合物对红细胞溶血的抑制作用。结果:2.1 FTC法测定结果显示木犀草素、木犀草苷、芹菜素、金合欢素、金合欢苷在45、90、180μg/ml对亚油酸系统脂质过氧化反应均有极显著的抑制作用,且随浓度增大抑制作用相应增强。总抗脂质过氧化能力强弱顺序为木犀草素>木犀草苷>2,6-二叔丁基对甲酚(即阳性对照物BHT)>芹菜素>金合欢素>金合欢苷。2.2五种黄酮类化合物对大鼠肝匀浆和脑匀浆的脂质过氧化反应结果表明:各剂量组丙二醛生成量(A532nm值)与模型组相比显著降低,说明对脂质过氧化均有显著抑制作用。木犀草素、木犀草苷、芹菜素、金合欢素、金合欢苷在最大剂量组时对大鼠肝匀浆的抑制率分别达到67.51±2.45、54.06±3.42、40.97±2.99、30.31±1.40、19.39±1.98%;对大鼠脑匀浆的抑制率分别为50.77±3.96、53.84±1.71、46.96±1.32、30.13±2.81、23.88±2.24%。根据脂质过氧化的半数抑制浓度(IC50),五种化合物对大鼠肝匀浆及脑匀浆脂质过氧化抑制作用的强弱顺序可表示为:木犀草素>木犀草苷>芹菜素>金合欢素>金合欢苷。2.3加入不同浓度的五种黄酮类化合物后,红细胞溶血率均低于模型组,说明木犀草素、木犀草苷、芹菜素、金合欢素、金合欢苷均可显著抑制红细胞溶血的发生,其中,木犀草素的抑制作用最显著,当其浓度为30μg/ml时,溶血抑制率达到92.82±6.80%。木犀草素、木犀草苷、芹菜素、金合欢素的IC50分别为0.06、0.41、0.52、0.57mmol/L;而金合欢苷浓度为0.67mmol/L时抑制率达到最高为38.31%。因此,五种化合物对红细胞溶血抑制作用的强弱顺序为木犀草素>木犀草苷>芹菜素>金合欢素>金合欢苷。第三部分河北香菊中黄酮类化合物清除DPPH自由基作用研究目的:研究河北香菊中五种黄酮类化合物对DPPH自由基的清除作用。方法:采用紫外可见分光光度法测定加入不同浓度药物后DPPH甲醇溶液在516nm处吸光度值的变化,计算DPPH自由基的清除率。结果:木犀草素、木犀草苷、芹菜素、金合欢素、金合欢苷及阳性对照2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)对DPPH自由基均有一定的清除作用,且呈现一定的剂量效应关系。其半数清除浓度(IC50)分别为59.06, 103.2, 393.05, 947.31, 1813.33, 146.06μg/ml。由此表明清除DPPH自由自能力的强弱顺序为木犀草素>木犀草苷>BHT>芹菜素>金合欢素>金合欢苷。第四部分黄酮类化合物结构与抗氧化活性关系探讨目的:研究黄酮类化合物结构与其抗氧化活性之间的关系。方法:通过对木犀草素、木犀草苷、芹菜素、金合欢素、金合欢苷的结构及抗氧化实验结果进行分析,探讨黄酮类化合物抗氧化作用的构效关系。结果:黄酮类化合物结构中的羟基位置、数量以及糖苷的空间位阻均可影响其抗氧化活性的强弱。结论:河北香菊提取物中五种黄酮类化合物能增强大鼠肝匀浆中谷胱甘肽过氧化物酶及过氧化氢酶的活性以及全血及血浆中谷胱甘肽过氧化物酶活性;具有抑制亚油酸系统、大鼠肝匀浆、脑匀浆中的脂质过氧化反应和红细胞溶血反应的作用;能够清除DPPH自由基。其抗氧化活性强弱顺序表现为木犀草素>木犀草苷>芹菜素>金合欢素>金合欢苷。这一结果与其结构中的羟基位置、数量以及糖苷的空间位阻均可影响其抗氧化活性的强弱。