目的:探讨 IQ motif containing GTPase activating protein 3（IQGAP3）在高级别浆液性卵巢癌增殖和转移能力中的作用。背景:卵巢癌是最常见的妇科肿瘤之一。它对女性生命造成严重的威胁而影响全世界的妇女。由于缺乏适当的筛查方法,大多数病例在晚期被诊断出来,而生存率低。在过去的十年中,新的卵巢癌病例的发病率每年平均下降2.3%。尽管如此,近年来总的存活率并未显示出任何显著的提高。目前美国所有期别的卵巢癌病例的5年生存率约为47%。但是大约60%的新病例被诊断时已为晚期,在这些病例中其5年生存率仅为29%左右。另外,即使在积极的多模态治疗之后仍存在较高的复发率。这进一步恶化了卵巢癌的预后。因此它被认为是“沉默杀手”。IQGAP3（含有GTPase激活蛋白3的IQ基序）是Rho家族GTP酶的成员,它在几种癌症的发生和发展中起着重要的作用。IQGAP家族的三个成员已在人类癌症中描述过、三个成员都配备著4个IQ模序和一个Ras GAP相关领域。IQGAP的GAP相关结构介导其与GTP酶Rho家族的结合。CDC42是GTP酶Rho家族的成员之一;已显示在细胞增殖,存活,粘附和迁移中起关键作用并且与各种癌症的不良预后有相关。研究已表明IQGAP3参与上皮细胞的增殖。2007年被发现的IQGAP3是IQGAP家族的新成员。它位于1q21.3位点的1号染色体上。据报道它在多种类型的癌症中起癌基因的作用。它是一种跨膜蛋白;被认为是潜在的治疗靶标。迄今为止,IQGAP3在卵巢癌的发病机理和进展中的作用向未明确。在这项研究中,我们探讨了IQGAP3在卵巢癌中的异常表达以及涉及各种致癌过程的机制。本研究分为以下几部分:IQGAP3在卵巢癌中的表达特征及临床病理的关系;IQGAP3对卵巢癌生物学行为的影响;IQGAP3参与卵巢癌作用机制的研究。第1部分IQGAP3在卵巢癌中的表达特征及临床病理的关系目的:IQGAP3已被发现在胰腺癌、胃癌、肾癌、乳腺癌、肝细胞癌等多种癌症中表达升高。分析TCGA公共数据库的数据显示IQGAP3在卵巢癌标本中的水平明显升高。同样分析公共数据集也表明IQGAP3的过表达与患者预后较差有关。在这项研究中我们调查了 IQGAP3在高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）样本和正常输卵管样本中mRNA和蛋白质水平上的表达水平。我们进一步探讨了 IQGAP3差异表达与临床病理参数的相关性,以证明IQGAP3在卵巢癌中的临床意义以及确定IQGAP3在卵巢癌进展和侵袭性中的作用。方法:我们分析了 IQGAP3在卵巢癌和正常输卵管样本中的差异表达水平。采用实时PCR分析IQGAP3 mRNA的表达采用蛋白质印迹和免疫组化的方法进一步研究IQGAP3蛋白在癌症和对照样品之间的表达水平。然后使用标准的统计方法确定了IQGAP3差异表达在卵巢癌病例中的临床病理意义。我们还分析了 The Cancer Genome Atlas（TCGA）数据库的相关数据并研究临床病理相关性。HGSOC样品中IQGAP3的蛋白表达更高。（p<0.05）4.免疫组织化学染色显示与输卵管样本相比,HGSOC组织样本中的IQGAP3过表达。5.IQGAP3的高表达与几个临床病理参数（CA125、复发、腹膜转移）之间存在统计学意义。6.Kaplan Meier生存分析表明在IQGAP3高表达和低表达的TCGA病例中总生存（OS）和无进展生存（PFS）存在显着差异。结论:与正常输卵管标本相比IQGAP3在卵巢癌中显着过表达。IQGAP3的过表与一些临床病理参数有关而且影响患者的预后。结果:1.TCGA数据显示IQGAP3在HGSOC中的表达明显高于正常组织（p<0.05）。2.RT-PCR分析显示与正常输卵管样本相比HGSOC样本中mRNA的表达明显更高。（p<0.05）3.Western blot分析也证实了 PCR的发现;与输卵管样品相比Western blot显示第2部分IQGAP3对卵巢癌生物学行为的影响目的:已证明IQGAP3积极参与多种癌症的各种致病过程。据报道它在诸如增殖、迁移、侵袭、凋亡等关键过程中起作用。在这项研究中我们研究了 IQGAP3在卵巢癌生物学行为中的功能性作用。该研究探索了 IQGAP3过表达在体外和体内在卵巢癌的发生、增殖、迁移和侵袭中的作用。我们进一步研究了 IQGAP3在卵巢癌细胞系凋亡潜能中的作用。此外我们研究了 IQGAP3在对PARPi药物（例如olaparib）的化学敏感性中的功能作用。方法:我们首先通过免疫印迹证实了 IQGAP3在卵巢癌细胞系（A2780、HEY、SKOV3、OVCAR3）中的表达水平并将其与输卵管细胞FTE187和正常卵巢上皮细胞系HOSEPIC的表达谱进行了比较。然后我们使用两个siRNA敲低IQGAP3的表达及研究其在卵巢癌细胞的各种生物学行为中的作用。进行MTT测定和克隆形成测定以评估对体外细胞增殖能力的影响。Transwell分析用于研究IQGAP3组合在体外迁移和侵袭中的作用。我们还使用慢病毒载体用IQGAP3 shRNA稳定转染了细胞并将这些稳定转染的细胞用于体内肿瘤形成测定和转移测定。通过生物发光成像技术进一步研究了裸鼠的肿瘤发生和转移。我们还证明了使用western blot技术敲除IQGAP3导致相关标志物表达的改变。此外,Annexin V-FITC/PI双重染色和流式细胞仪用于研究IQGAP3对体外细胞凋亡能力的影响。MTT分析显示IQGAP3的敲低会增强卵巢癌细胞对PARPi药物（如奥拉帕尼）的化学敏感性。结果:1.免疫印迹的结果显示,在各个细胞中进行瞬时以及稳定转染后IQGAP3表达水平显着下降。2.MTT分析显示两种siRNA瞬时转染后卵巢癌细胞系的增殖潜力显着降低3.克隆试验还显示与对照组相比siRNA转染的细胞的克隆形成能力减低了。4.Trasnwell分析显示与对照组相比转染siRNA的细胞系迁移和侵袭程度较低。5.体内肿瘤发生分析显示与对照组相比裸BALB-c小鼠的肿瘤形成能力降低。与对照组相比接种了稳定转染细胞的小鼠显示出较少的转移灶。生物发光研究也阐述了这些发现。6.流式细胞仪显示在敲低IQGAP3后细胞系中具有更高的凋亡潜能。7.当使用两种siRNA敲除IQGAP3时使用olaparib的化学敏感性增加。这通过MTT分析进行评估。8.Western blot显示敲低IQGAP3后几种与迁移和侵袭相关的EMT相关蛋白发生了改变。上皮标记物E-CAD的表达增加、而间充质标记物N-CAD、ZEB-1、Vimentin、SnaiI的表达减少。与细胞凋亡相关的蛋白质标记物也通过蛋白质印迹显示出改变。促凋亡标志物Bax、Caspase 3、Caspase 9的表达升高而抗凋亡蛋白标志物Bcl-2的表达降低。结论:IQGAP3的过表达在体内外均显着影响卵巢癌的增殖、迁移和侵袭。IQGAP3的表达升高对PARPi药物olaparib的凋亡潜力和化学敏感性也有显着影响。第3部分研究IQGAP3在卵巢癌中的作用机制目的:IQGAP3功能作用背后的机制目前还在研究阶段。已经有研究集中在可能与IQGAP3的工作有关的几种信号传导途径上。据报道IQGAP3通过EGFR-ERK途径在肺癌中发挥其致病作用。还据报道IQGAP3是CDC42的效应子IQGAP3可能通过调节CDC42发挥功能。在这项研究中我们研究了 IQGAP3在HGSOC各个方面发挥作用的机制。该研究还探讨了 CDC42在IQGAP3调控中的作用。我们还研究了 PI3K/AKT/mTOR信号传导途径作为IQGAP3在HGSOC中发挥其增殖和迁移作用的潜在机制。方法:为确定IQGAP3是否与卵巢癌CDC42相关通过敲低IQGAP3表达来评估卵巢癌细胞CDC42的蛋白表达水平。我们评估了敲低IQGAP3后CDC42的表达。然后评估CDC42对癌细胞的作用。我们通过瞬时转染进行了 CDC42的敲除。然后确定了细胞功能的变化;例如增殖、迁移、侵袭和凋亡。我们使用MTT测定法确定增殖使用和不使用Matrigel的transwell测定法评估迁移和侵袭潜能而通过流式细胞仪测定凋亡潜能。我们还进行了免疫印迹以确定在敲低IQGAP3后PI3K/AKT/mTOR蛋白表达水平的变化。结果:1.敲低IQGAP3同时降低CDC42的表达。2.降低CDC42表达导致HEY细胞增殖潜能显着降低。3.CDC42敲低后细胞的迁移和侵袭也下降。4.发现CDC42敲低后细胞凋亡潜力增强。5.蛋白质印迹分析显示敲低IQGAP3后细胞中PI3K、p-AKT、p-mTOR的蛋白质水平降低。结论:IQGAP3与CDC42密切相关而可能通过CDC42的调控发挥其致病功能。PI3K/AKT/mTOR信号通路在IQGAP3在卵巢癌的生物学功能中具有重要作用。