目的:本课题主要根据吉西他滨限速机制设计合成吉西他滨的结构改造药,希望增加其药效并改善吉西他滨的给药方式。本课题主要检测结构改造药的药物活性和毒性。同时,探索吉西他滨的耐药机制,并筛选出有潜力的中药活性成分。方法:1.MTT实验验证结构改造药的体外药效本实验选用胰腺癌,非小细胞肺癌和乳腺癌细胞系检测药物的药效。通过MTT实验对比不同药物在相同浓度下,不同时间处理后,对各个肿瘤细胞的活力影响。同时通过蛋白印迹法,检测以上肿瘤细胞和正常乳腺细胞,正常肺上皮细胞中关键蛋白脱氧胞苷激酶（Deoxycytidine Kinase,DCK）的表达。2.4T1移植瘤模型验证体内药效通过移植瘤实验,验证结构改造药物在体内的抑瘤效果。实验室合成的结构改造药物和吉西他滨,LY2334737进行对比,所有结构改造药和LY2334737均相同浓度每天口服给药;吉西他滨采用腹腔注射给药,药物处理两周后解剖。3.吉西他滨改造药L119与结构改造阳性药NUC-1031的药效学对比研究通过移植瘤模型,扩大样本量,进一步验证筛选出来的结构改造药L119的药效以及毒性。同时加入NUC-1031作为阳性对照药,同对比二者腹腔注射和灌胃给药的毒性。第一次实验吉西他滨和NUC-1031采用腹腔注射给药,L119灌胃给药。第二次实验,二者均灌胃给药,对比NUC-1031和L119二者口服的药效以及毒性。第三次实验,二者均腹腔给药,对比NUC-1031和L119腹腔注射给药的药效以及毒性。4.吉西他滨耐药机制和c-myc关系的研究通过使用c-myc抑制剂降低胰腺癌细胞系的c-myc的表达,在c-myc表达降低的情况下检测吉西他滨对胰腺癌细胞杀伤作用的改变。通过联合指数判断c-myc抑制剂是否和吉西他滨有协同作用。同时通过转染实验,对比c-myc过表达的时候,吉西他滨对胰腺癌细胞杀伤作用的改变。培养吉西他滨的耐药株Panc-1,并对比耐药株和非耐药株中c-myc和PD-L1表达改变。5.中药活性成分逆转吉西他滨耐药的药效学研究根据文献调研和实验室研究基础,筛选出18个对胰腺癌有杀伤作用的中药活性成分。通过SRB实验,检测各个中药活性成分对胰腺癌细胞Panc-1活力的影响;同时联合吉西他滨一同给药,检测药物药效的改变,从而计算其联合指数,判断中药活性成分是否和吉西他滨有协同作用。6.统计分析数据分析采用SPSS 19.0统计软件来进行,P≤0.05表示不同的处理组之间具有显著性统计学差异。GraphPad 5.0数据分析软件作图,所得数据结果以Mean ± SD表示。结果1.体外实验中显示结构改造药在4T1有较好的抑瘤效果经过药物处理后,结构改造药在乳腺癌细胞系4T1的抑瘤效果最优。检测各细胞系的本底表达,结果显示4T1的关键蛋白DCK的表达量最低,因此改造药相较吉西他滨可以在4T1细胞上更有优势。2.结构改造药L119对4T1移植瘤模型有治疗作用口服结构改造药两周后,计算各组的抑瘤率,筛选出结构改造药L119,其药效和吉西他滨相近,且二者的抑瘤效果均优于口服阳性药LY2334737。3.结构改造药L119和阳性药NUC-1031有相似的药效及毒性第一次实验,在相同浓度下,口服结构改造药L119和腹腔给药NUC-1031的药效相当。但是本次实验L119出现较为明显的毒副作用,有比较明显的胃肠道毒性。第二次实验,L119和NUC-1031均设计口服给药,结果显示NUC-1031和L119口服给药均有明显的胃肠道毒性,验证该部分的改造不适合口服给药。第三次实验,结构改造药L119和NUC-1031均腹腔给药对比二者药效。结果显示,腹腔给药下L119和NUC-1031的抑瘤效果相当,且腹腔给药二者均没有出现明显的毒副反应。说明该结构比较适合腹腔注射。4.c-myc的高表达对吉西他滨药效作用呈负相关在用抑制剂下调c-myc后,吉西他滨对胰腺癌细胞系的杀伤作用明显增强,呈中度协同作用。而在过表达c-myc后,吉西他滨对胰腺癌的杀伤作用显著减弱。结果说明c-myc高表达对吉西他滨的杀伤作用呈负相关。在吉西他滨耐药株Panc-1中,c-myc和PD-L1在基因和蛋白均显著上调。5.青蒿琥酯对胰腺癌Panc-1的生长有抑制作用通过SRB实验,检测中药活性成分单独或者联合吉西他滨时对Panc-1的抑制作用,并且检测各个成分和吉西他滨的联合作用。结果显示,青蒿琥酯单独使用对胰腺癌细胞系Panc-1的活力有较好的抑制作用。结论本课题主要检测吉西他滨的结构改造药的活性和毒性,结果显示结构改造药L119有明显的体内抑瘤效果但是存在明显的口服毒性,不能改善给药方式。因此后续考虑从吉西他滨的耐药机制出发,进行研究,为后续的新药研究提供基础,并筛选出有潜力的中药活性成分青蒿琥酯。