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青蒿素是从青蒿(Artemisia annua L.)中分离的倍半萜内酯化合物,是目前疗效最好的抗疟药物。青蒿素合成途径已经研究的比较清楚,而青蒿素合成途径中代谢产物的转运机制并无报道。此外,青蒿中非分泌型腺毛也具有合成和贮存大量的倍半萜化合物的能力,例如β-石竹烯(β-caryophyllene),β-法尼烯(β-farnesene)和大根香叶烯(germacrene D)等。青蒿非泌腺毛中倍半萜化合物相关的转运蛋白和转运机制的研究也没有报道。目前报道与植物萜类化合物转运相关的转运蛋白都属于ABC转运蛋白的PDR亚家族,因此,本研究的重点集中在青蒿PDR亚家族转运蛋白。本研究以青蒿为材料,经转录组数据分析,对在分泌型腺毛和非分泌型腺毛中特异表达的AaPDR1和AaPDR3转运蛋白进行功能分析,取得的研究结果如下:一、AaPDR1转运蛋白参与青蒿素合成的转运。本研究从青蒿分泌型腺毛转录组数据库中鉴定出89个ABC转运蛋白,通过进化树分析和不同组织的表达情况分析,筛选到AaPDR1转运蛋白基因。AaPDR1基因在分泌型腺毛中表达量最高;不同发育阶段的叶片表达分析证明该基因在幼嫩叶片表达量最高,随着叶片衰老,表达量不断降低;GUS染色结果证明AaPDR1基因只在青蒿的分泌型腺毛中表达。抑制AaPDR1基因的表达导致转基因青蒿中青蒿素,二氢青蒿酸和青蒿酸的含量显著降低;在过量表达青蒿植株中,青蒿素和青蒿酸含量显著提高,而二氢青蒿酸的含量大幅度提高,约为野生型对照的13倍。此外,酵母突变体转运实验证明AaPDR1在酵母中参与二氢青蒿酸的外排转运。这些实验结果证明AaPDR1很可能参与青蒿素合成直接前体物质二氢青蒿酸的转运。二、AaPDR3转运蛋白参与β-石竹烯的转运。本研究从青蒿非分泌型腺毛转录组数据库中筛选出88个ABC转运蛋白基因。通过进化树分析,筛选出候选基因AaPDR3。AaPDR3基因在青蒿非分泌型腺毛中表达量最高;不同发育阶段叶片的表达分析证明该基因在幼嫩的叶片中表达量最低,随着叶片衰老,表达量不断提高。GUS染色发现AaPDR3基因只在青蒿非分泌腺毛和根中表达。亚细胞实验证明AaPDR3转运蛋白定位在细胞质膜上。抑制AaPDR3基因的表达导致转基因青蒿中倍半萜化合物β-石竹烯含量显著降低;过量表达AaPDR3基因导致转基因植株中β-石竹烯含量提高。酵母突变体转运实验证明转运蛋白AaPDR3参与β-石竹烯的摄取转运。因此,AaPDR3转运蛋白在青蒿中参与了倍半萜β-石竹烯的转运。综上所述,本研究从青蒿中克隆到分泌型腺毛特异性表达的转运蛋白基因AaPDR1和非分泌腺毛特异性表达的转运蛋白基因AaPDR3,通过实验证明这两个转运蛋白都涉及到青蒿中倍半萜化合物的转运。