功能完整的肠道屏障是机体防止有害物质如细菌和内毒素等易位而进入内环境的有力保证,其中机械屏障最为重要,而上皮细胞间紧密连接作为机械屏障的重要结构,其损伤能引起细胞通透性增加,引发肠道疾病。亮氨酸作为一种必需氨基酸,对肠道紧密连接有影响,但其作用分子机制尚不清楚,本研究旨在进一步揭示L-亮氨酸调控肠道紧密连接的作用其及分子机制。以体外培养的猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)为模型,我们首先通过检测跨上皮电阻(TEER)发现亮氨酸使细胞通透性减小,且用不同浓度的亮氨酸(0、0.1、0.5、2和4 mM)处理细胞后进行荧光实时定量PCR,结果显示0.5 mM Leu诱导claudins基因表达的作用明显。为了进一步探索Leu上调claudins基因表达的分子机制,我们使用雷帕霉素预处理细胞,发现Leu对基因表达的诱导作用受到抑制;之后构建sestrin2和mTORC1敲低细胞系及qPCR结果表明,mTORC1参与Leu对claudin-3、-5和-8的调控,其中claudin-3的表达受亮氨酸感知体sestrin2的抑制。同时,用BAY11-7082(一种IKK抑制剂)预处理细胞也能抑制Leu对紧密连接相关基因的诱导;通过构建Rel A(转录因子NF-κB组成成分)敲低细胞系,发现转录因子NF-κB也参与了Leu对claudin-3和claudin-8基因表达的调控。最后,蛋白质免疫印迹结果显示,亮氨酸能诱导NF-κB磷酸化,且这种诱导作用能被雷帕霉素阻止,表明Leu通过mTORC1诱导NF-κB磷酸化。综上所述,在IPEC-J2细胞中,亮氨酸可能通过sestrin2-mTORC1-NF-κB细胞信号通路调控上皮细胞紧密连接相关基因表达,从而改变细胞间通透性,改善肠道屏障。