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株高是水稻的重要农艺性状,决定了水稻的抗倒伏能力、理想株型和产量。鉴定挖掘并有效利用矮秆新资源,深入研究调控引起水稻矮秆的分子机制,将有助于加快水稻高产育种进程,为分子设计育种改良水稻株型提供理论指导。本论文以水稻组培过程产生的小粒矮秆突变体small grain and dwarf2(sgd2)为研究材料,对sgd2的表型进行了鉴定,通过图位克隆分离到一个影响水稻生长发育的关键因子SGD2,并对该基因进行了深入研究,揭示了引起sgd2生长发育缺陷的分子机制。全文结果如下:
1.突变体sgd2与野生型Kitaake相比,在营养生长期就表现出明显的生长发育迟缓表型,种子萌发率低,幼苗矮小,根长变短,生长缓慢,抽穗拔节后,株高18.7cm左右,各节间及穗部长度均缩短,分蘖数减少,结实率降至4%左右。sgd2的种子呈现出小圆粒表型,其粒长、粒宽均显著下降,千粒重只有18.2g左右,与Kitaake的27.8g相比,降低了34.5%左右。
2.激光共聚焦显微镜观察发现,sgd2的茎尖顶端分生组织面积明显小于Kitaake,成熟植株最上节间细胞切面观察发现,sgd2的纵向细胞长度明显小于Kitaake,横切面细胞面积也显著下降,说明sgd2的矮化主要是由于节间细胞长度降低引起的。扫描电镜观察成熟种子颖壳外表皮细胞发现,sgd2的细胞长度缩短,推测这是粒型变小的直接原因。
3.遗传分析表明,sgd2×IRAT129后代F1表现为高秆,sgd2表型由隐性单基因控制。利用该F2后代遗传群体将小粒矮秆基因定位于1号染色体长臂83.8Kb的物理距离内,基因组测序发现区间内Os01G0643600基因发生9个碱基的缺失。利用转基因互补和敲除技术,证明了Os01G0643600基因即为正向调控水稻株高和粒型的基因,命名为SGD2,功能注释为HD-ZipⅡ类转录因子家族成员HOX3。
4.RT-PCR和GUS组织染色分析表明,SGD2是一个组成型表达基因,在水稻幼根、幼苗、茎节中都有表达,在未开花的幼穗中表达最高。通过水稻原生质体瞬时表达及SGD2-GFP水稻转基因幼根观察发现,SGD2主要定位于细胞核。酵母和荧光素酶活性测定实验表明,SGD2是一个转录抑制子,不具有转录激活功能。
5.植物生理学实验表明,苗期sgd2能够响应外源GA3处理,第2片叶鞘长能恢复到Kitaake的水平,抽穗拔节前不同梯度浓度的GA3喷施处理发现,sgd2和Kitaake的响应程度基本一致,其株高伸长比率没有显著差异。sgd2背景下过表达GA20ox1基因,转基因植株呈现高秆表型。HPLC实验表明,与Kitaake相比,sgd2植物内源GA1含量下降了2/3,由此推测sgd2的赤霉素合成途径受影响。
6.酵母双杂交实验证明了SGD2能与其同源蛋白HOX1、HOX2互作,三个蛋白都能靶定到D18(GA3ox2)基因的启动子。sgd2/d18双突变体表现出累加效应,株高比sgd2或d18都矮,推测SGD2与D18可能处于同一个调控通路上。
1.突变体sgd2与野生型Kitaake相比,在营养生长期就表现出明显的生长发育迟缓表型,种子萌发率低,幼苗矮小,根长变短,生长缓慢,抽穗拔节后,株高18.7cm左右,各节间及穗部长度均缩短,分蘖数减少,结实率降至4%左右。sgd2的种子呈现出小圆粒表型,其粒长、粒宽均显著下降,千粒重只有18.2g左右,与Kitaake的27.8g相比,降低了34.5%左右。
2.激光共聚焦显微镜观察发现,sgd2的茎尖顶端分生组织面积明显小于Kitaake,成熟植株最上节间细胞切面观察发现,sgd2的纵向细胞长度明显小于Kitaake,横切面细胞面积也显著下降,说明sgd2的矮化主要是由于节间细胞长度降低引起的。扫描电镜观察成熟种子颖壳外表皮细胞发现,sgd2的细胞长度缩短,推测这是粒型变小的直接原因。
3.遗传分析表明,sgd2×IRAT129后代F1表现为高秆,sgd2表型由隐性单基因控制。利用该F2后代遗传群体将小粒矮秆基因定位于1号染色体长臂83.8Kb的物理距离内,基因组测序发现区间内Os01G0643600基因发生9个碱基的缺失。利用转基因互补和敲除技术,证明了Os01G0643600基因即为正向调控水稻株高和粒型的基因,命名为SGD2,功能注释为HD-ZipⅡ类转录因子家族成员HOX3。
4.RT-PCR和GUS组织染色分析表明,SGD2是一个组成型表达基因,在水稻幼根、幼苗、茎节中都有表达,在未开花的幼穗中表达最高。通过水稻原生质体瞬时表达及SGD2-GFP水稻转基因幼根观察发现,SGD2主要定位于细胞核。酵母和荧光素酶活性测定实验表明,SGD2是一个转录抑制子,不具有转录激活功能。
5.植物生理学实验表明,苗期sgd2能够响应外源GA3处理,第2片叶鞘长能恢复到Kitaake的水平,抽穗拔节前不同梯度浓度的GA3喷施处理发现,sgd2和Kitaake的响应程度基本一致,其株高伸长比率没有显著差异。sgd2背景下过表达GA20ox1基因,转基因植株呈现高秆表型。HPLC实验表明,与Kitaake相比,sgd2植物内源GA1含量下降了2/3,由此推测sgd2的赤霉素合成途径受影响。
6.酵母双杂交实验证明了SGD2能与其同源蛋白HOX1、HOX2互作,三个蛋白都能靶定到D18(GA3ox2)基因的启动子。sgd2/d18双突变体表现出累加效应,株高比sgd2或d18都矮,推测SGD2与D18可能处于同一个调控通路上。