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目的:食管癌中90%是食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma cells,ESCC),少数为食管腺癌,维生素和微量元素等营养物质的缺乏、与亚硝胺和霉菌素等致癌物的接触、人类乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)、EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)等病毒的感染以及烟酒等不良的生活习惯等环境因素都是食管癌发生的诱因,并且在环境因素和遗传因素的共同作用下极易导致食管癌的发生。研究证明,有研究表明PAR4在食管癌鳞状细胞中表达降低可能是由于PAR4基因启动子区的高甲基化,提示PAR4基因启动子区域的甲基化对其在食管癌中表达有一定影响,但是在食管癌发生中的作用尚不清楚,需要进一步研究。本研究应用PAR4特异性激动剂PAR4激活肽(PAR4-AP)孵育ESCC,应用蛋白质谱标记技术(Tandem Mass Tag,TMT)方法对PAR4活化后ESCC基因差异表达进行蛋白质组学分析,应用蛋白免疫印迹(western blot),免疫组织化学,xCELLigence细胞功能分析仪DP系统和MTT验证其结果以及发现PAR4活化在ESCC中潜在的治疗价值。方法:1.应用蛋白质谱标记技术(Tandem Mass Tag,TMT)方法检测PAR4-AP孵育食管癌鳞状细胞(EC9706)6小时后的蛋白变化情况。2.PAR4-AP孵育食管癌鳞状细胞(EC9706),0小时,1小时组、2小时组、6小时组、12小时组、24小时组,提取总蛋白,Western bolt法验证TMT变化比较明显的5种蛋白CHMP1B、PURA、PARG、HIST1H2AH和CASPASE。3.应用免疫组织化学方法观察PAR4,P53,PURA,PARG,CASPASE9和HIST1H2AH在食管癌上皮组织中的表达变化。4.PAR4-AP孵育食管癌鳞状细胞(EC9706),0小时,1小时组、2小时组、6小时组、12小时组、24小时组,提取总蛋白,Western bolt法验证TMT变化比较明显的5种蛋白CHMP1B、PURA、PARG、HIST1H2AH和CASPASE。5.用xCELLigence细胞功能分析仪DP系统,检测对照组,PAR4-AP孵育食管癌鳞状细胞(EC9706)(实时监测72小时内)细胞增殖。6.用MTT实验方法检测PAR4-AP孵育食管癌鳞状细胞(EC9706),0小时,1小时组、2小时组、6小时组、12小时组、24小时,计算食管癌鳞状细胞的存活率。结果:TMT结果显示食管癌鳞状细胞共有5,225多种蛋白。其中33种蛋白发生变化,包括15种表达上调的蛋白和18种表达下调的蛋白。GO(Gene ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析表明,上调的基因包括肿瘤凋亡相关的基因(例如CASPASE9),下调的基因包括抗和凋亡、自噬、促细胞增殖相关的基因(如CHMP1B、PURA、PARG和HIST1H2AH)。2.western blot检测PAR4-AP孵育食管癌鳞状细胞,0小时,1小时组、2小时组、6小时组、12小时组、24小时,CHMP1B、PURA、PARG和HIST1H2AH在食管癌鳞状细胞中表达下降,CASPASE9表达上升,与TMT结果基本一致。3.PAR4、p53、CHMP1B、PURA、PARG和HIST1H2AH在食管癌上皮组织中与正常食管癌上皮组织的表达变化。(1)免疫组织化学中观察到PAR4在食管癌上皮组织表达量减少,与正常食管上皮组织相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)免疫组织化学中观察到变异型P53在食管癌上皮组织表达增加,与正常的食管上皮组织相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)免疫组织化学中观察到CHMP1B、PURA、PARG和HIST1H2AH在食管癌上皮组织表达增加,与正常的食管上皮组织相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.用xCELLigence细胞功能分析仪DP系统,检测对照组,PAR4-AP孵育食管癌鳞状细胞(实时监测72小时内)细胞增殖,结果显示PAR4-AP能够抑制食管癌鳞状细胞的增殖。5.用MTT实验方法检测PAR4-AP孵育食管癌鳞状细胞,0小时,1小时组、2小时组、6小时组、12小时组、24小时,PAR4-AP孵育后的食管癌鳞状细胞活力明显低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:1.PAR4-AP可以改变食管癌鳞状细胞的蛋白表达谱。2.活化后的PAR4可能通过细胞的凋亡、自噬和抑癌基因参与食管癌鳞状细胞的调控。3.活化后的PAR4可能对食管癌鳞状细胞的增殖具有抑制作用。