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目的:前期已初步发现了BMP9能有效抑制TNBC的细胞生长、迁移和侵袭,在此研究基础上,从TMEM100的角度探讨BMP9抑制TNBC的增殖、EMT及促进细胞自噬的作用及机制。方法:第一部分:应用UALCAN数据库预测TMEM100在乳腺癌中的表达,并通过qRT-PCR法在乳腺癌细胞株中进行体外验证。将过表达TMEM100质粒转染到MDA-MB-231细胞中构建TMEM100/MDA-MB-231过表达重组细胞,将shTMEM100质粒转染到BT-549细胞中构建shTMEM100/BT-549干扰重组细胞。通过MTT法检测细胞增殖的变化、transwell法检测迁移及侵袭的变化;westernblot检测Vimentin和Snail蛋白量的变化。第二部分:应用GCBI和TargetScanHuman7.2数据库预测调控TMEM100基因表达相关的miRNA。将Ad-BMP9、Ad-siALK1和miR-195-5p-mimic分别转染到MDA-MB-231细胞中构建BMP9/MDA-MB-231、siALK1/MDA-MB-231和mimic/MDA-MB-231重组细胞。通过qRT-PCR检测BMP9对ALK1、miRNA和TMEM100表达的影响;miR-195-5p、siALK1对TMEM100表达的影响;双荧光素酶报告法验证miR-195-5p对TMEM100的靶向作用;westernblot实验检测BMP9对TMEM100蛋白表达的影响。体内实验中,通过IHC实验检测BMP9/MDA-MB-231移植瘤中TMEM100蛋白的表达情况。第三部分:将Ad-BMP9及shTMEM100共转染到MDA-MB-231细胞中构建BMP9/shTMEM100/MDA-MB-231重组细胞。流式周期术分析细胞周期的情况;westernblot法检测Snail、N-Cadherin、E-Cadherin与Vimentin蛋白量的改变。细胞凋亡实验检测凋亡小体形成情况;mRNA表达谱芯片检测BMP9对自噬基因表达的影响;IF实验检测BMP9和TMEM100对LC3蛋白的表达和亚细胞定位的影响;westernblot验检测BMP9和TMEM100对LC3、ATG7、ATG5、AMPK-α及p-AMPK-α表达量的影响。体内实验中,通过皮下成瘤实验检测BMP9/shTMEM100/BT-549肿瘤生长的变化,IHC实验检测移植瘤中PCNA表达量的变化。结果:第一部分:体外实验发现TMEM100在乳腺癌中的表达水平降低,此结果与UALCAN数据库预测相符。敲低TMEM100后,shTMEM100/BT-549细胞中的TMEM100表达水平明显降低(P<0.001)、但Vimentin和Snail表达水平增加、增殖、迁移和侵袭能力增强(P<0.001)。而过表达TMEM100后,则观察到相反结果。第二部分:GCBI和TargetScanHuman7.2数据库预测与qRT-PCR实验结果显示,miR-195-5p可能参与BMP9调控TMEM100的过程。在BMP9/MDAMB-231细胞中发现过表达BMP9增加了ALK1、miR-195-5p和TMEM100的表达(P<0.05)。但在siALK1/MDA-MB-231细胞中TMEM100的表达水平显著下调(P<0.05)。在mimic/MDA-MB-231细胞中发现TMEM100的表达升高(P<0.05)。双荧光素酶报告法结果显示,mimic可以靶向结合TMEM100的3’-UTR区,并上调TMEM100的表达(P<0.05),而inhibitor抑制TMEM100表达(P<0.05)。沉默miR-195-5p与TMEM100 3’-UTR区结合位点后,未观察到任何现象。体内实验中,过表达BMP9同样可促进TMEM100的表达。第三部分:在BMP9/shTMEM100/MDA-MB-231细胞中,干扰内源性TMEM100表达后外源性过表达BMP9后,发现BMP9抑制癌细胞增殖和EMT的能力减弱。通过分析mRNA表达谱数据以及对BMP9组和GFP组的基因扩增数做比值后,发现BMP9可能促进自噬基因LC3、ATG5、ATG7、ATG12表达。体外实验中,过表达BMP9和TMEM100后,LC3在细胞核中聚集且LC3、ATG7、AMPK-α和p-AMPK-α的蛋白表达量均增加。而在BMP9/shTMEM100/MDA-MB-231细胞中,LC3、ATG7、AMPK-α和pAMPK-α的蛋白表达量减少。过表达TMEM100后加入AMPK通路抑制剂,在TMEM100/WZ4003/MDA-MB-231细胞中发现LC3和ATG5的蛋白表达量减少。结论:TMEM100抑制TNBC细胞的增殖、侵袭、迁移和EMT进程,且其表达受BMP9调控。BMP9通过ALK1和miR-195-5p靶向上调TMEM100的表达,并通过TMEM100抑制TNBC细胞增殖和EMT,同时激活TMEM100/AMPK信号通路从而促进细胞自噬。综上所述,BMP9通过miR-195-5p靶向上调TMEM100的表达,从而抑制TNBC细胞的增殖和EMT进程,并通过TMEM100/AMPK信号通路促进自噬发生。