论文部分内容阅读
目的传统的观点认为,成年中枢神经系统(central nervous system,CNS)的再生能力非常弱,在个体出生后不久,CNS内的神经元就不再产生,一旦受损将无法再生;然而,近年来人们发现,在成年哺乳动物脑内某些区域持续产生神经干细胞(neural stem cell,NSC),其中自脑室下区(subventricular zone,SVZ)产生的NSC沿喙侧迁移流(Rostral migratory-stream, RMS)不断向嗅球迁移,对嗅觉的学习和记忆具有重要意义,这为CNS的损伤修复带来了新的希望,但脑缺血后神经再生及功能恢复仍较困难,其中有二个重要原因:一个原因是成年个体脑内增殖的NSC数量较少、增殖时间较短,能够迁移至缺血区并存活下来的细胞数量有限;二是脑内某些轴突生长抑制因子的存在,它们对CNS轴突再生具有明显的抑制作用,严重阻碍受损的神经纤维的再生,其中排斥性导向分子A (repulsive guidance molecule A,RGMa)就是一种对轴突生长具有强大抑制作用的膜蛋白。本研究目的为对正常大鼠进行嗅球损伤和电刺激,观察其对SVZ区NSC增殖、迁移和分化的影响,进而再对脑缺血再灌注大鼠进行嗅球电刺激,观察其对脑缺血再灌注大鼠SVZ区NSC增殖、迁移、分化和脑内RGMa表达的影响,以探讨嗅球与脑内神经发生与轴突再生的关系,为脑梗死的治疗提供新的方法。方法1.对正常大鼠分别进行嗅球损伤和电刺激,嗅球内局部注射N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid, NMDA)制作嗅球损伤模型,右侧嗅球内埋置电极制作嗅球电刺激模型,以5-溴脱氧尿嘧啶(5-bromo-2-deoxyuridine,Brdu)标记NSC,以免疫组化法观察嗅球损伤及电刺激对SVZ区NSC增殖和迁移的影响,以免疫荧光双标法检测嗅球内NSC的分化情况。2.对脑缺血再灌注大鼠进行嗅球电刺激,以线栓法建立大鼠右侧大脑中动脉缺血(middle cerebral artery occlusion,MCAO)/再灌注模型,右侧嗅球内埋置双极电极,于脑缺血再灌注后立即对嗅球进行电刺激,以Brdu标记NSC,以免疫组化法观察电刺激嗅球对SVZ区NSC增殖及向缺血皮质迁移的情况,以免疫荧光双标法检测缺血侧皮质NSC的分化情况。3.对脑缺血再灌注大鼠进行嗅球电刺激后,对大鼠进行改良的神经功能缺损评分(modified neurological severity score,mNSS),以RT-PCR法对RGMa mRNA在脑内的表达进行半定量分析,以Western blot法检测RGMa蛋白的表达情况;以免疫组化法观察RGMa、神经丝蛋白-200(neurofilament -200,NF-200)在大脑皮质的分布及表达情况;以2 ,3 ,5 -三苯基氯化四氮唑(triphenyltetr-azolium chloride,TTC)染色计算各组大鼠脑梗死体积。结果1.大鼠嗅球损伤后1d, SVZ区Brdu阳性细胞开始增高,第7天达高峰,以后有所下降,但第4周仍有较高水平表达(P<0.01)。注射Brdu 4周后,嗅球损伤组大鼠喙侧迁移流及嗅球内的Brdu阳性细胞数较正常对照组和生理盐水组明显增多,荧光双标示大部分Brdu阳性细胞同时表达神经元标志物神经元核抗原(Neuronal nuclei antigen, Neun),少部分细胞表达星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)。电刺激嗅球后1d,大鼠SVZ区Brdu阳性细胞开始增高,第7天达高峰(P<0.01),第3周达对照组水平。注射Brdu 4周后,电刺激组大鼠RMS及嗅球内的Brdu阳性细胞数较正常对照组和假刺激组明显增多,但电刺激嗅球对嗅球内NSC向神经元或星形胶质细胞方向的分化没有影响。2.Brdu免疫组化染色显示,缺血再灌注组、假刺激组和电刺激组大鼠SVZ区Brdu阳性细胞在脑缺血后48h较假手术组明显增多(P<0.01),缺血7d时更为明显(P<0.01),在各时间点,电刺激组较其它组Brdu阳性细胞数多,差异有显著性;缺血后4周,缺血侧皮质区电刺激组Brdu阳性细胞数较缺血再灌注组和假刺激组显著增多(P<0.01),免疫荧光双标染色示电刺激组大部分Brdu阳性细胞同时表达Neun,小部分Brdu阳性细胞同时表达GFAP,提示大部分新生NSC分化为神经元,但与缺血再灌注组和假刺激组比较,新生NSC分化为神经元或星形胶质细胞的比例没有显著差异(P>0.05)。3.神经功能评分显示大鼠脑缺血再灌注后mNSS评分显著下降,但电刺激组mNSS评分较缺血再灌注组和假刺激组有所提高,两两比较均有统计学意义(P<0.01);经RT-PCR检测,缺血再灌注组大鼠48h时RGMa mRNA水平较假手术组显著增高,1w时有所下降,电刺激组RGMa mRNA表达水平也高于假手术组,但不如缺血再灌注组表达明显(P<0.01),与此相类似,Western blot显示电刺激组RGMa蛋白表达水平较假手术组高,但低于缺血再灌注组和假刺激组(P<0.01);免疫组化染色示缺血再灌注组和电刺激组大鼠脑内RGMa表达均较假手术组增多,但电刺激组RGMa表达升高程度不如缺血再灌注组明显(P<0.01);NF-200免疫组化染色示脑缺血再灌注后缺血侧皮质NF-200表达显著下降,电刺激48h组NF-200表达与缺血再灌注组无明显差异,但电刺激7d组NF-200表达明显升高;大鼠脑TTC染色发现电刺激组梗死体积明显小于缺血再灌注组(P<0.01)。结论1.大鼠嗅球损伤及电刺激均可促进SVZ区NSC增殖及其向嗅球迁移,嗅球损伤组新生细胞不但可以分化为神经元,也可分化为星形胶质细胞,并可能参与损伤后的修复作用;电刺激嗅球对大鼠新生NSC的分化没有影响。2.电刺激嗅球可促进脑缺血大鼠SVZ区NSC增殖,并可能促进新生NSC向缺血皮质迁移,增加缺血皮质新生神经细胞数量,且不影响SVZ区新生NSC的分化。3.电刺激嗅球可下调脑缺血再灌注大鼠皮质和海马内RGMa的表达,促进轴突再生,减少梗死体积,改善神经功能。