溶磷菌wj1中磷酸盐特异性转运系统相关基因的功能鉴定

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无机磷酸盐是所有生物体必需的营养元素,其利用途径开始于无机磷酸盐的跨膜转运。细菌中有两个主要的无机磷酸盐转运系统:无机磷酸盐转运系统(Phosphate inorganic transport,Pit)和磷酸盐特异性转运系统(Phosphate specific transport,Pst)。Pit系统是一个低亲和力、高速的转运系统,由质子动力势提供能量。Pst系统是一类ABC转运蛋白,对无机磷酸盐的亲和力高,由ATP驱动转运无机磷酸盐。细菌通过Pit和Pst系统完成在高磷和低磷条件下无机磷酸盐的转运,满足细菌对磷素营养的需求。通过对高磷和低磷条件下培养的溶磷菌wj1的转录组测序,发现与Pst系统相关的基因,并对其进行一系列基础研究,主要取得以下成果:通过对土壤中常见细菌属的500个菌株的Pst系统进行比较,发现不同的菌株中编码Pst系统的基因有所不同,可分为三类。第一类由五个基因编码,包括pstSCAB-phoU。第二类也由五个基因编码,与第一类不同的是含有两个pstB基因,不存在phoU基因。第三类只由pstSCAB四个基因编码,没有发现phoU基因。通过PCR法得到Pst系统基因间隔区pstCA和pst AB,得知溶磷菌wj1中编码Pst系统各组分的基因连续排列,全长7120 bp,包括pstS2CAB-phoU。因此确定,溶磷菌wj1中Pst系统属于第一类。利用生物信息学在线分析软件,对psts1、pstS2、pstC、pstA、pstB和phoU各个基因的理化性质,蛋白质二级结构,信号肽,跨膜区,保守结构域及三级结构进行分析,为进一步研究基因的功能提供理论基础。克隆得到磷酸盐结合蛋白基因pstS1和pstS2的核酸序列,开放阅读框长度分别为1335 bp和999 bp。成功构建pstS1和pstS2基因原核表达载体pET-28a-pstS1和pET-28a-pstS2,其中psts2基因在约37.0 KDa处明显出现诱导表达条带,成功表达出目的蛋白。对重组菌株的磷酸盐结合能力进行检测,发现重组菌株磷酸盐结合能力增强。当磷酸盐浓度在0.2-0.5 mg·mL-1时,重组菌株结合磷酸盐的能力高,当磷酸盐的浓度大于1.0 mg·mL-1时,结合磷酸盐的能力显著下降。随着菌体密度的增大,重组菌株结合磷酸盐的能力增强,在OD600为2.0达到最高。当OD600为2.0,磷酸盐浓度为0.4 mg·mL-1时,磷酸盐结合率最高,达到79.54%。此结果表明磷酸盐结合蛋白PstS2对磷酸盐的亲和力高,Pst系统在低磷条件下发挥作用。
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