目的E-cadherin (E-cad,上皮型钙粘蛋白,CDH1蛋白)主要表达在人和动物的上皮细胞,是一种能够介导细胞与细胞、细胞与基质之间粘附的跨膜糖蛋白,对于维持上皮细胞的结构和形态起到非常重要的作用。E-cadherin目前被普遍认为是一种抑癌因子,原因在于E-cadherin的表达下调或缺失能够引发EMT(Epithelial to Mesenchymal Transition),即细胞由上皮类型向间质类型转化,EMT的发生使得细胞排列疏松,运动能力变强,进而引发肿瘤细胞转移和侵袭。目前已经发现E-cadherin在在诸多肿瘤如胃癌、结肠癌中表达下调,特别在肝细胞肝癌中缺失程度较高,并且与预后等有较密切的关系,但是肝细胞肝癌中E-cadherin表达缺失的机制尚不是非常明确。炎症,特别是慢性炎症在在癌变中发挥重要作用,其通过肿瘤微环境中的炎性细胞及介质促进肿瘤的发展。肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是浸润到肿瘤中最主要也是最关键的一种炎症细胞。在肝细胞肝癌中,TAM参与了肝癌的发生,增殖等多个过程,并且有研究显示,TAM密度与肝癌预后不良有关。但是在肝细胞肝癌中,TAM介导转移的潜在功能及机制还不清楚。本课题通过对肝细胞肝癌病人组织切片中E-cadherin的表达和TAM的浸润的分析,在体外用分别用两种肝癌细胞系与巨噬细胞共培养模拟体内微环境,证明肝细胞肝癌中E-cadherin、相关基因的表达及细胞的迁移能力与TAM的浸润密切相关,并通过抑制肝癌细胞系内的NF-κB信号通路证明,巨噬细胞可能通过活化肝癌细胞内NF-κB通路来引起以上的变化。方法一通过免疫组织化学方法检测肝癌病人组织切片中E-cadherin与TAM的表达(1)肝细胞肝癌病例切片的选取本课题收集山东大学齐鲁医院病理科肝细胞肝癌病人的肿瘤组织石蜡贮存块,并得到连续切片。所有病人在手术前没有接受任何程度的放射或化疗治疗。病人的性别、年龄、肿瘤大小及病理分级等资料都是来自病人的病历记录。(2)通过免疫组织化学方法检测连续组织切片中E-cadherin与CD68的表达采用免疫组织化学方法,在厚度为4毫米的肝癌病人连续组织切片中对E-cadherin和CD68的表达分别进行检测。E-cadherin一抗为鼠抗(1：100稀释)；CD68一抗为鼠抗(1：100稀释),二抗均为连接有辣根过氧化物酶的兔抗鼠抗体。PH9.0的EDTA抗原高压热修复,3%过氧化氢内源性封闭。一抗在湿盒内孵育过夜,使用DAB试剂盒显色,并使用苏木素复染细胞核。E-cadherin和CD68分别通过不加一抗来设立阴性对照组。(3)连续切片中E-cadherin和TAM数目的相关性分析利用显微镜拍照系统对封片后的连续组织切片拍照,每张切片选取5至6个视野,200倍放大,TIFF格式保存。使用Image-Pro Plus version6.0软件对E-cadherin和CD68的阳性表达进行平均光密度分析并对TAM进行计数。所得到的数据通过GraphPad Prism5软件对其相关性进行分析。二肝癌细胞系与THP-1来源的巨噬细胞共培养并检测E-cadherin及与EMT发生相关基因的表达变化(1)肝癌细胞系与THP-1来源的巨噬细胞共培养人肝癌细胞系BEL-7402和SMMC-7721及人单核细胞系THP-1均来自中国科学院-上海细胞所,分别用1640、EMEM、DMEM加10%胎牛血清配制的培养基37℃、5%CO2常规培养。以320nM终浓度的佛波酯(PMA)诱导THP-1细胞24小时,使其贴壁为巨噬细胞,用PBS洗净PMA,利用孔径为0.4um的Transwell小室分别与7402和7721共培养。(2) RT-PCR检测E-cadherin及相关基因的表达变化共培养6小时、24小时后收集细胞,利用Trizol法提取细胞总RNA进行RT-PCR检测,检测基因有E-cadherin,及其上游抑制基因Snail、Slug、Twist,另有能促进肿瘤侵袭的基质金属蛋白酶MMP2, MMP9。(3) Western Blotting检测E-cadherin的表达变化共培养48小时后收集细胞,提取总蛋白进行western blotting的检测。三肝癌细胞系与人外周血单核细胞来源的巨噬细胞共培养并检测E-cadherin及与EMT发生相关基因的表达变化(1)人外周血单核细胞的提取及分化抽取24个健康志愿者静脉血,并在无菌环境中通过Ficoll-密度梯度离心方法分离得到外周血单个核细胞(PBMCs),将其接种于6孔板中,贴壁筛选后用PMA刺激24小时,得到巨噬细胞。(2)肝癌细胞系与人外周血单核细胞来源的巨噬细胞共培养利用Transwell小室将7402及7721两种肝癌细胞系同上述得到的巨噬细胞共培养6小时、24小时。(3) RT-PCR检测E-cadherin及EMT相关基因的表达变化共培养6小时、24小时后收集细胞,利用Trizol法提取细胞总RNA进行RT-PCR检测,检测基因有E-cadherin,及其转录因子Snail、Slug、Twist,另有MMP2, MMP9。四检测THP-1来源的巨噬细胞对肝癌细胞形态变化的影响与THP-1来源的巨噬细胞共培养48小时后,将7402和7721放在镜下观察形态变化并用显微镜进行拍照。五检测THP-1来源的巨噬细胞对肝癌细胞迁移能力的影响将肝癌细胞7402,7721接种于6孔板上,等细胞长到一定的密度,用10ul移液枪头划痕,PBS清洗,拍照记录。与THP-1来源的巨噬细胞共培养48小时后再次拍照,目的是通过细胞愈合的程度来反映巨噬细胞对肝癌细胞迁移能力的影响；将巨噬细胞刺激贴壁后24h收集上清,代替肝癌细胞系常规培养基,通过孔径为8um的Transwell小室迁移实验来检测巨噬细胞对肝癌细胞迁移能力的影响。六阻断肝癌细胞内的NF-κ B信号通路后共培养并检测E-cadherin及EMT发生相关基因的变化(1)肝癌细胞内NF-κ B信号通路的阻断及共培养利用二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)对两种肝癌细胞内的NF-κ B信号通路进行阻断,PBS洗净PDTC阻断剂后与THP-1来源的巨噬细胞共培养。(2)检测E-cadherin及EMT相关基因的表达变化收集细胞,通过RT-PCR和Western Blotting的方法检测E-cadherin、Snail、 Slug、Twist、MMP2、MMP9等基因的表达变化。七阻断肝癌细胞内的NF-κ B信号通路后共培养并检测肝癌细胞的迁移能力利用PDTC对7721细胞内的NF-κ B信号通路阻断,在与巨噬细胞共培养的过程中通过细胞划痕实验来检测肝癌细胞的迁移能力。结果一肝细胞肝癌病人组织切片中E-cadherin的表达与TAM浸润的数量呈负相关(1) E-cadherin和TAM在组织切片中的表达情况对肝细胞肝癌切片进行免疫组化检测,E-cadherin表达位置主要在细胞膜；正常肝组织、癌旁高表达,局部的肝癌组织存在不同程度的低表达或缺失。E-cadherin与TAM的相关性分析：每张切片选取E-cadherin高表达、低表达视野各3个,共计83个视野；TAM浸润的情况可用CD68表达的来表示,并对TAM进行计数。(2)连续切片中E-cadherin的高低和TAM数目的相关性分析E-cadherin高表达组的TAM浸润个数较少,平均为58个；低表达组的TAM浸润个数较多,平均为172个,两组TAM数目差别的P值<0.0001,具有显著性差异。上述结果表明E-cadherin在局部的表达高低同浸润的TAM数目具有负相关性。二与THP-1来源的巨噬细胞共培养后肝癌细胞E-cadherin表达下调与THP-1来源的巨噬细胞共培养6小时、24小时后在mRNA水平上检测到7402和7721的E-caderin在mRNA水平上出现明显的下调,P值<0.001；共培养48小时后蛋白水平上也检测到这两种肝癌细胞系E-caderin的表达明显降低。三与THP-1来源的巨噬细胞共培养后肝癌细胞诱发EMT的基因出现不同程度的表达升高共培养6小时、24小时后在mRNA水平上检测7402的E-caderin转录因子Slug、Twist表达升高,MMP9升高；7721的MMP9升高。上述结果表明,共培养通过单独或联合上调Slug、Twist转录因子来抑制E-cadherin的表达,并且上调MMP9表达,促进EMT的发生。四与人外周血单核细胞来源的巨噬细胞共培养后肝癌细胞E-cadherin及与EMT发生相关基因变化用人外周血单核细胞代替THP-1刺激得到巨噬细胞与肝癌细胞共培养,再次检测上述基因,结果与二、三相似,说明无论是从THP-1细胞系还是人外周血单核细胞刺激得到的巨噬细胞都能诱导E-cadherin下调。五与THP-1来源的巨噬细胞共培养后肝癌细胞的形态由上皮类型转化为间质类型共培养48小时后,7402排列变得疏松,细胞间隙变大,细胞形态由近圆多边形变为中间宽,两头窄的梭型；7721排列紧变得疏松,细胞间隙变大,细胞形态由多边形转化为长梭型,并在细胞的两极或单极出现丝状伪足；这两种肝癌细胞系的形态被巨噬细胞诱导由上皮类型转化为间质类型。六与THP-1来源的巨噬细胞共培养后肝癌细胞的迁移能力增强与巨噬细胞共培养的同时对肝癌细胞做细胞划痕实验,结果7402迁移距离较大,共培组平均迁移867um,对照组为530umm,两组P值为<0.001,差异明显；7721共培组迁移平均距离为283um,对照组只有112umm,P值<0.0001,差异显著。另外,巨噬细胞上清代替常规培养基,Transwell小室检测7402的迁移能力,结果为：接种10000个细胞的上清组平均迁移67/视野,对照组平均17/视野；接种100000个细胞上清组平均迁移1363/视野,对照组平均506/视野,差异均显著。上述结果显示,同THP-1来源的巨噬细胞共培养后两种肝癌细胞系的迁移能力明显增强。七阻断肝癌细胞内的NF-κ B信号通路后,肝癌细胞E-cadherin诱导下调的现象受到抑制利用PDTC阻断肝癌细胞内NF-κ B信号通路后共培养,mRNA及蛋白水平上均发现E-caherin诱导表达升高的现象被抑制。八阻断肝癌细胞内的NF-κ B信号通路后,肝癌细胞迁移能力诱导增加的现象消失利用PDTC阻断7721细胞内NF-κ B信号通路后,通过划痕实验检测细胞的迁移能力,结果是对照组、共培组、PDTC-共培组的迁移细胞平均距离分别为：112um、283um、83um;统计分析发现,PDTC-共培组细胞迁移能力明显下降,明显低于共培组,但与对照组没有显著性差异。上述结论证明,肝癌细胞内的NF-κ B信号通路在巨噬细胞促EMT效应中起到了至关重要的作用。结论一肝细胞肝癌组织中,E-cadherin的表达与TAM浸润的数量呈负相关。二在体外,巨噬细胞能过下调肝癌细胞E-cadherin的表达及诱导EMT的发生。三肝癌细胞内NF-κ B信号通路在巨噬细胞促EMT效应中起到了关键作用。