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剑麻是全球和我国热区最重要的麻类经济作物,其综合利用前景十分广阔。剑麻斑马纹病和剑麻茎腐病是当前我国剑麻生产上最严重的毁灭性的传染性病害,可造成植麻区麻株大量死亡,产量大幅降低。且由于剑麻是多年生植物,生命周期较长,一般8年以上才能开花,再加上我国目前剑麻育种基础薄弱,种质资源少,给剑麻的杂交育种带来了很大困难。因此通过构建剑麻的再生体系,进而开展抗病基因转化研究,缩短剑麻抗病育种年限,提高育种时效,培育多抗高产品种,对促进我国剑麻产业的稳步发展具有重要的意义。
本文采用植物组织培养技术,以剑麻幼叶为外植体,进行了愈伤组织的诱导试验,并成功的诱导出苗,建立了从愈伤组织到植株的再生体系,并利用农杆菌介导初步探索了剑麻遗传转化的研究,为下一步开展抗病基因导入,培育转基因剑麻抗病品种提供基础。
主要研究结果如下:
1.幼嫩的剑麻叶片愈伤诱导率较老的叶片高,且诱导出的愈伤分化率高。
2.愈伤组织在N6培养基中比在MS培养基中启动快。幼嫩叶片(叶龄2~3周)在N6培养基上27d即出现白色晶体状愈伤组织点。
3.对剑麻叶片在附加不同质量浓度配比的NAA、6-BA、2,4-D的N6培养基中进行愈伤诱导实验,结果表明N6+6-BA3.0mg/L+NAA0.2mg/L,N6+NAA0.2mg/L+6-BA3.0~4.0mg/L+2,4-D0.5~1.0mg/L对剑麻叶片愈伤组织诱导效果优于其它浓度配比。
4.高浓度的细胞分裂素6-BA和低浓度的生长素NAA配合使用能促进愈伤诱导出芽,而用TDZ代替6-BA效果更显著,可以加速出芽的时间。本研究中诱导愈伤组织出芽的最优培养基是MS+NAA0.05mg/L+TDZ1.5mg/L。
5.剑麻不定芽增殖培养的最适培养基为MS+NAA0.05mg/L+6-BA2.0mg/L,分化不定芽最多,增殖系数达4.4,且增殖芽长得较壮。
6.剑麻生根的最优培养基为MS+IAA1.0mg/L,12天左右便能长出须状根,生根率达96%,且根多、较短粗、叶色浓绿、植株粗壮。
7.剑麻愈伤组织的Hyg基础抗性浓度为30mg/L,在此浓度培养基中剑麻愈伤组织褐化死亡率达100%。
8.预培养在剑麻的遗传转化过程中是必要的,对外植体进行预培养能有效地促进植物细胞分裂,从而促进外源DNA的整合。剑麻愈伤组织在预培养2d后的GUS瞬时表达效果最好,达到28.6%。
9.剑麻愈伤组织侵染时间为10minGUS瞬间表达率较高。