第一部分:小鼠原代神经元体外培养与纯度鉴定目的:细胞培养技术是基础医学研究中重要的实验方法,原代培养是指从机体直接取下细胞、组织和器官后立即进行培养。目前对大脑神经元的形态特征、物质代谢、生理和药理过程的研究主要集中在细胞水平和分子水平。原代培养的方法可对单个神经细胞的结构和功能进行研究,提供了体内生长过程在体外重现的机会,是一种有效反映在体神经元活动的实验模型。原代神经细胞培养能较长时间观察细胞的形态和功能变化,易于施行如物理、化学或生物刺激等实验条件,作用更加直接,并且便于各种神经疾病在细胞和分子水平机制的探讨。由于神经元是一种高度分化的细胞,动物出生后一般不分裂,因此建立一种可靠、稳定、简单易行的原代神经元培养方法十分必要。为了解决这一问题,本研究在参考既往培养方法的基础上,探讨简便、可行的新生小鼠皮质神经细胞原代培养模型,旨在为进一步从细胞分子水平上研究动物中枢系统病变奠定基础。方法:从胎龄16天的C57BL/6胎鼠脑组织提取皮层神经元细胞,显微镜下分离,置于含有2mg/ml木瓜蛋白酶的D-Hank’s平衡盐溶液中37℃15分钟,用含10%胎牛血清的DMEM培养液终止反应。接种于事先用多聚赖氨酸浸泡过的孔板内,加入Neurobasal/B27无血清维持液,在37℃和5%CO2条件下培养细胞。于接种2h后半量换液为Neurobasal/B27无血清维持液,细胞生长24h后用于后续试验。以NSE染色鉴定神经元细胞,GFAP染色鉴定星形胶质细胞。利用免疫荧光法鉴定GLP-1R存在。结果:1倒置相差显微镜观察:神经元细胞呈圆形或椭圆形,体积小,胞体发亮,周边光晕明显,立体感强,细胞突起长,细胞间连接多。2荧光显微镜观察:NSE抗体染色,荧光为绿色,存在于大多数细胞的胞质和突起中。GFAP抗体染色,仅有零星细胞的胞浆和突起有绿色荧光染色。3 Anti-β-tubuliⅢ染色显示清晰的神经元,细胞浆呈绿色,胞体为梭形或多角形。使用GLP-1R抗体进行细胞免疫荧光鉴定,可见有红色荧光。图像融合后发现,GLP-1R在细胞内广泛表达,说明原代培养神经元细胞表达GLP-1R。第二部分:利拉鲁肽对神经细胞突起长度的影响目的:胰高血糖素样肽-1(glucagon-likepeptide-1,GLP-1)受胃肠道食物主要为碳水化合物等营养物质刺激,由小肠L细胞(内分泌细胞)分泌的一种重要肠激素相关肽,由胰高血糖素原基因转录并翻译加工而成,主要被二肽基肽酶IV(DPP-IV)降解,经肾排泄。GLP-1具有血糖依赖性促胰岛素分泌,通过抑制α细胞不适当分泌胰高血糖素、促进胰岛β细胞分泌胰岛素、延缓胃排空及抑制食欲等多种调节手段控制机体血糖的稳态。同时,GLP-1还通过改善β细胞功能、抑制β细胞死亡、促进β细胞增殖,使胰岛素合成增加,进一步延缓甚至逆转2型糖尿病的发展。以肠促胰素为基础的2型糖尿病治疗方案已在临床广泛应用。GLP-1主要通过GLP-1受体(glucagon-likepeptide-1 Receptor,GLP-1R)发挥多种生物学作用。GLP-1R于胰腺、肺、脑、心和肾脏等器官中广泛存在,正是其广泛的分布决定了作用的广泛性。在对啮齿类动物和人类心血管组织的研究中发现GLP-1可以结合心血管部位表达的GLP-1R,说明GLP-1在心血管系统中发挥作用[1];对大鼠肺组织的研究证明了GLP-1在产生表面蛋白、建立肺结构及成熟中十分重要,近期研究显示,利拉鲁肽可能通过抑制过度激活的肺组织局部RAAS抑制TGF-β1来改善肺间质纤维化[2];对肾功能的基础实验结果证实,肠促胰素可修复2型糖尿病患者肾损伤,其机制包括抑制肾素-血管紧张素系统的激活、减少尿白蛋白、减轻炎性反应、改善肾脏循环以及减轻肾纤维化等[3]。随着GLP-1各种胰腺外作用的发现,其中GLP-1对脑组织的研究格外引人关注。近期小鼠研究显示,如阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森疾病(Parkinson’s disease,PD)、萎缩性脊髓侧索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS)和卒中等神经退行性疾病,GLP-1具有保护记忆和突触可塑性,减少炎症反应的作用。并且GLP-1还可有效保护大鼠海马神经元细胞不受谷氨酸诱导的死亡和铁诱导的细胞凋亡。动物研究显示,GLP-1R基因敲除小鼠较野生型小鼠学习能力底下、对红藻氨酸诱导的惊厥更易感。另外,也有研究报道Exendin-4,GLP-1R激动剂,在神经突起数量和长度、细胞骨架重组和电生理学方面对人神经母细胞瘤具有保护作用。以上众多研究均显示GLP-1类似物对神经系统发挥正向作用,但多数是对动物行为学的评估,离体研究较少,从细胞水平上有哪些变化尚未明确,加入药物是否在细胞水平、分子水平直接发生变化,以及发生变化的作用机制也鲜有研究。由于神经系统是各个神经元相互联系的功能整合体,通过反馈环路调节自身功能,包含一系列多分枝神经元与临近神经元的突触-轴突接触。有研究显示震颤患者相对于健康者表现出树突棘密度和树突复杂性降低,可见神经生长也是神经发育、再生、分化及对损伤反应的重要步骤。因此本研究选用神经突起长度作为检测神经作用的指标。方法:细胞接种24h后,向无血清培养液中加入不同浓度利拉鲁肽,使培养液中药物终浓度分别为10n M、100n M、1μM,对照组加入等量PBS。使用免疫荧光显像,观察不同浓度下利拉鲁肽对神经突起长度的影响,对神经突起进行长度测量,所得数据输入统计学软件SPSS13.0中进行分析比较。结果:1利拉鲁肽促进神经突起增长具有剂量反应关系。不同浓度利拉鲁肽(10n M,100n M,1μM)处理神经细胞24h后检测神经突起长度,结果显示各处理组神经突起平均长度显著长于对照组(P<0.05),分别为30.21±6.64μm,34.90±6.15μm,29.37±5.10μm,对照组:21.29±4.07μm。并且在后续试验中,选择100n M作为干预剂量。2 MEK–ERK信号通路抑制剂U0126抑制利拉鲁肽诱导的神经突起长度增长。实验将细胞随机分组,依次为对照组、利拉鲁肽组、抑制剂组及利拉鲁肽+抑制剂组。细胞培养24h后,检测神经突起长度:利拉鲁肽+抑制剂组(23.89±7.02μm)神经突起平均长度显著低于单独应用利拉鲁肽组(31.95±1.04μm)(P<0.05),但仍比对照组(20.43±3.90μm)平均神经突起长度长(P<0.05);另外,抑制剂组(21.01±3.20μm)与对照组神经突起平均长度无统计学差异(P>0.05);利拉鲁肽组神经突起平均长度显著长于对照组,与前述试验结果一致。第三部分:利拉鲁肽促进神经突起生长的机制研究目的:细胞外调节激酶(Extracellular signal regulated kinases,ERK)作为丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase,MAPK)家族的重要成员之一,与细胞的生长、分化和增殖密切相关,主要包括P-ERKl和P-ERK2。磷酸化ERK(Phosphorylated extracellular signal regulated kinases,p-ERK)是ERK的活化形式。Ras最先被相关生长因子受体和胞浆中酪氨酸激酶等激活,活化的Ras使c-Raf,MEK,ERK激活,由胞浆转移至细胞核的p-ERK,作用于核内数种转录因子和核蛋白,随后激活后续一系列转录过程,参与细胞的生长、发育、增殖、分化和凋亡。作为重要的核转录因子,c AMP反应序列结合蛋白(c AMP response element binding protein,CREB)对启动子中具有环磷酸腺苷反应单元(CRE)的基因转录进行调节,在神经元再生、突触形成以及学习记忆等方面具有重要作用,是细胞内多种信号通路的关键成分。大量研究显示,GLP-1类似物利拉鲁肽可通过激活Akt、MEK1/2,对甲基丙酮醛刺激下人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y具有保护作用。GLP-1保护糖尿病小鼠β细胞由于细胞因子诱导的所致凋亡、保护阿尔兹海默病小鼠记忆损伤均通过MEK-ERK途径。许多证据也表明,ERK信号途径可以引起CREB磷酸化,p38MAPK途径参与此过程。ERK、CREB等作为普遍存在于细胞内的重要因子,本实验探讨利拉鲁肽是否通过此信号途径影响细胞功能,并利用U0126(MEK-ERK通路)抑制剂阻断假设通路进行验证。方法:探讨MEK-ERK信号通路相关基因在利拉鲁肽促进神经突起生长作用中的表达。将原代神经元随机分组为对照组、利拉鲁肽组、MEK-ERK通路抑制剂U0126组及利拉鲁肽+U0126组,利用Western blot和ELISA技术,检测各组ERK、p-ERK和CREB表达。结果:1 MEK-ERK信号途径参与利拉鲁肽诱导的神经突起长度增长。Western Blot结果显示,利拉鲁肽组p-ERK表达较对照组表达明显增多,利拉鲁肽+抑制剂组表达量降低(P<0.05)。然而,抑制剂组与对照组间p-ERK表达水平无明显差异(P>0.05)。2磷酸化CREB是利拉鲁肽调节神经突起生长的关键下游分子。ELISA检测结果显示,抑制剂组与对照组p-CREB表达无明显差异(U0126组:5.58±0.61 ng/ml;对照组:5.28±0.82 ng/ml,P>0.05)。利拉鲁肽促进p-CREB表达,此作用可被U0126部分抑制(利拉鲁肽组:11.31±1.35ng/ml;U0126+利拉鲁肽组:7.84±2.78 ng/ml,P<0.05)。第四部分:利拉鲁肽对高糖环境下神经细胞的影响及其机制研究目的:临床及基础实验中均发现,糖尿病与神经系统疾病密切相关。痴呆的危险性在糖尿病患者中明显增加,如发生记忆和学习等脑功能损害。流行病学研究结果表明伴有胰岛素抵抗症状的糖尿病患者发展为阿尔茨海默病者约占30.65%。由于高血糖导致自由基增加、氧化应激反应增强、内皮细胞功能紊乱、糖基化终末产物在血管壁累积、醛糖还原酶活性增加导致细胞内持续高渗等,最终造成细胞死亡。雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,m TOR)作为细胞内重要的调节基因,通过对细胞能量的合成与代谢、蛋白质的合成与降解、细胞周期等多种途径的调节干预,在其生长、增殖、分化与凋亡等过程中发挥重要的作用。许多关于中枢神经系统的研究显示,一些神经系统退行性疾病种存在异常m TOR信号转导通路和神经元细胞减少或丧失。细胞死亡包括两种形式,即细胞凋亡和细胞坏死。细胞凋亡的具体机制目前尚未明了,但促凋亡蛋白Bax与抗凋亡蛋白Bcl-2两者之间的平衡,在细胞的凋亡过程中起到了十分重要的作用。本研究通过体外培养胎鼠原代皮层神经元细胞,观察不同浓度GLP-1类似物(利拉鲁肽)对神经突起长度的作用及MEK-ERK信号通路相关基因表达的影响,就GLP-1对神经元细胞的作用机制进行初步探讨,随后将细胞置于高糖环境模拟糖尿病神经系统疾病,再次探讨利拉鲁肽对神经细胞活性的影响,并关注药物对凋亡的作用,为GLP-1类药物应用于糖尿病及神经疾病的治疗提供新的思路。方法:将原代神经元置于高糖培养基中,加入不同浓度利拉鲁肽,使培养液中药物终浓度分别为10-9M、10-8M、10-7M、10-6M,10-5M,10-4M,对照组加等量生理水,使用CCK-8法检测细胞活性。随后将细胞随机分为对照组,高糖组,高糖+利拉鲁肽。使用Hoechst 33342染色观察细胞凋亡情况,利用Western blot和RT-PCR进一步检测相关蛋白表达:Akt、m TOR、HIF-1a、Bcl-2、Bax和claudin-5,观察药物对各蛋白表达的影响。结果:1利拉鲁肽部分减弱高糖对神经元的损害作用。CCK-8实验检测高糖环境下利拉鲁肽对细胞活性的作用,结果显示:以标准培养基培养神经元作为对照,细胞活性100%,高糖组神经活性降低(31.78±2.81),加入不同浓度利拉鲁肽细胞活性增加(10-9M:32.20±4.03;10-8M:43.98±4.06;10-7M:74.92±5.59;10-6M:63.29±8.18;10-5M:52.00±6.01;10-4M:30.89±2.08),呈剂量依赖性,10-7M作用最为明显,但仍低于对照组,各组间有统计学差异(P<0.05)。由此可见,高糖对神经元活性具有损害作用,利拉鲁肽可部分缓解高糖所致的损伤,10-7M作用最为明显,后续试验中选择10-7M作为干预剂量。2 Hoechst 33342凋亡核染色证明利拉鲁肽减弱高糖对神经细胞的凋亡作用。正常细胞核Hoechst 33342染色呈淡蓝色,有深染的蓝色颗粒,而凋亡细胞的细胞核呈分叶、碎片状,被染成浓集的亮蓝色。实验显示,高糖下细胞呈现典型的凋亡形态学特征,胞体逐渐变得空瘪,细胞核皱缩,部分呈碎状浓染。加入利拉鲁肽后,现象有所缓解。计数200个细胞,对照组凋亡数为24个(凋亡率12%),高糖组凋亡数为62个(凋亡率31%),高糖利拉鲁肽组凋亡数为41个(凋亡率20.5%)。3利拉鲁肽通过Akt/m TOR/HIF-1a通路神经细胞凋亡因子Bcl-2、Bax进行调节。Western blot和RT-PCR结果显示:与对照组相比,高糖组Akt、m TOR和HIF-1a各指标蛋白和m RNA表达降低,加入最佳剂量利拉鲁肽后,蛋白和m RNA水平显著增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,高糖组较对照组Bcl-2蛋白和m RNA表达降低,加入利拉鲁肽后表达增加,但仍低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。高糖组Bax蛋白和m RNA较对照组表达升高,加入利拉鲁肽后,蛋白和m RNA表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。4高糖与利拉鲁肽对Claudin-5表达无明显影响。Claudin-5是反应血脑屏障功能的重要指标,离体研究中高糖与利拉鲁肽对其蛋白表白和m RNA表达均无明显改变,差异无统计学差异(P>0.05)。结论:1原代培养的胎鼠大脑皮层细胞中富含神经元细胞,形态良好,胶质细胞含量少,达实验要求。神经元细胞存在GLP-1受体。2利拉鲁肽促进小鼠皮层神经元细胞突起增长,在一定范围内呈浓度依赖性。MEK-ERK通路抑制剂U0126可部分阻断利拉鲁肽对神经突起生长的促进作用,表明利拉鲁肽通过激活受体MEK-ERK途径发挥促突起增长作用。3利拉鲁肽通过激活ERK磷酸化发挥对神经突起增长的促进作用,其下游重要的核转录因子p-CREB参与此过程。4高糖抑制神经细胞活性,利拉鲁肽可部分减少高糖造成的细胞活性抑制,在一定范围内呈浓度依赖性。利拉鲁肽通过Akt/m TOR/HIF-1a通路减少高糖诱导的神经细胞凋亡。高糖与利拉鲁肽对血脑屏障相关因子claudin-5表达无明显影响。