目的:随着人们生活水平的提高和人口的老龄化,糖尿病(diabetes mellitus, DM)的发病率逐年升高,糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)也逐年增加,DN已成为导致终末期肾衰竭肾脏替代治疗的最常见原因。因此,在细胞分子水平以及基因水平探索DN的发病机制十分重要。系膜细胞在维持肾小球的结构和功能方面起着重要的作用,并且参与了多种肾小球疾病的致病过程。糖尿病肾病的病理基础为系膜细胞肥大和系膜细胞外基质积聚,是引起肾脏肥大、细胞外基质(ECM)增多并进一步导致肾小球硬化的重要原因。Megsin基因是从人类系膜细胞中分离出的一种新型基因,它在人、大鼠、小鼠系膜细胞中呈优势表达,主要在人类肾脏系膜细胞中表达,属于丝氨酸蛋白酶超家族(serpin)的一员。文献报告人类IgA肾病和糖尿病肾病及大鼠抗Thy-1肾炎的病变均表现为系膜细胞增殖和或系膜基质扩增,其致病机理和病变程度与megsin的表达水平是相关的,表明megsin表达可能通过介导细胞外基质的沉积和细胞生命周期参与肾小球硬化的过程。糖尿病时肾组织细胞周期异常不仅启动糖尿病肾病(DN)的发生而且也参与疾病进展。p27kip1基因是一个调控细胞周期并抑制细胞分裂的重要基因,主要与细胞周期素(cyclin)结合而发挥对细胞周期素-细胞周期依赖性蛋白激酶(cyclin- cyclin depedent kinase,CDKs)的抑制作用。p27kip1是近年来研究较多的细胞周期抑制剂(cyclin depedent kinase inhibitor ,CKI-s),可抑制几乎所有的cyclin-CDK复合物的激酶活性,对细胞周期起负调控作用。研究表明,p27kip1对于肾小球疾病中系膜细胞的肥大及肾脏肥大起着重要作用,其主要功能是作为CDK抑制因子参与细胞周期调控;正常情况下,p27kip1在G0/G1期表达增高,当细胞进入S期时表达下降,若某种因素刺激导致p27在系膜细胞中表达增高,则可使细胞周期停滞于G1期,导致细胞肥大。研究证明肾小球系膜细胞受不同因素作用后P27表达水平不同,说明P27在调节系膜细胞增值过程中起重要作用。P27在正常的静止期系膜细胞中呈结构性表达,体内实验中系膜细胞增殖也与p27蛋白表达水平密切相关,而且鉴于P27在调节系膜细胞增殖中的重要作用,许多研究亦将其作为抑制系膜细胞增殖的作用靶点,且通过某些直接或间接干预措施,上调或抑制P27蛋白的表达水平,从而达到抑制系膜细胞增殖或肥大的作用。本课题拟通过链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)诱导建立糖尿病小鼠模型,并通过尾静脉质粒注射法,将megsin质粒、megsin-siRNA质粒及空质粒经由尾静脉注入糖尿病小鼠体内,以此分成三组,采用单侧肾切除组为正常对照组,观察不同组肾脏病变的程度,并采用免疫组化方法检测不同组megsin、Ⅳ型胶原、P27的表达水平,采用蛋白印记(western-blot)半定量检测肾小球裂解液P27的蛋白表达水平,从而探讨megsin参与调节肾小球系膜细胞增殖乃至细胞周期调控的机制,为阐明DN的发病机制及寻找先进的治疗方法提供实验性理论依据。方法:选择清洁级健康雄性CD-1小鼠60只,体重(20～30g)克,首先行单侧肾切除,后随机分为4组,每组15只,随机抽取3组腹腔注射STZ(溶于0.1mol/L柠檬酸缓冲液,浓度为2%,pH值为4.5,注射剂量为60mg/kg)制备糖尿病小鼠模型,剩余15只做为正常对照组(A组)。48小时后测定血糖、尿糖,血糖≥16.7mmol/L且尿糖+++～++++确定为糖尿病小鼠模型。然后采用尾静脉质粒注射法,将megsin质粒、megsin-siRNA质粒及空质粒经由小鼠尾静脉注分别注入3组小鼠体内(15ug/kg,1次/周),连续12周。以此分为空质粒注入组-糖尿病对照组(B组),megsin质粒组(C组)及megsin-siRNA组(D组)。实验期间小鼠自由饮食,不使用胰岛素及其它降糖药物。分别于实验开始后1、2、12周各组任取5只小鼠测定肾重/体重、血肌酐(Scr)、24小时尿蛋白定量,然后处死,留取肾组织标本行HE染色,免疫组化染色检测肾组织megsin、Ⅳ型胶原、P27表达情况,蛋白印记法检测肾小球裂解液P27的蛋白表达水平。结果应用图像分析系统进行半定量分析。结果:1.一般情况B组、C组、D组大鼠注射STZ后4～5天即出现多饮、多食、多尿,逐渐消瘦,三组并无明显差异,而A组则无上述情况出现。2. 12周末KW/BW、24小时尿蛋白定量(UP)、血肌酐(Scr)升高,差异有显著性意义(P<0.01);C组和B组相比,12周末UP、Scr和KW/BW比值升高更为明显,差异有显著性意义(P<0.01)。B组和同期A组相比,BG一直明显升高,C组和B组相比,差异无显著性(P>0.01)。3.病理组织学改变:光镜下观察,A组在第一周时肾小球结构基本正常,在第2周以及12周时肾小球体积变大;B组、C组、D组肾小球体积增大,系膜细胞增生,细胞外基质增多。B组、C组系膜细胞数较同期A组、D组增多(P<0.01)。4.免疫组化结果:1周、2周、12周时B组、C组肾皮质megsin及Ⅳ型胶原的阳性表达均强于A组、D组(P<0.01),其中C组强于B组(P<0.01);D组肾皮质megsin及Ⅳ型胶原阳性表达强于A组(P<0.01)。1周、2周时B组、C组肾皮质P27的阳性表达均强于A组、D组(P<0.01),其中C组强于B组(P<0.01);D组肾皮质P27阳性表达强于A组(P<0.01);第12周时C组P27表达仍强于各组(P<0.01),而B组和D组无明显差异(P>0.01)。5.蛋白印迹法检测肾小球P27:1周、2周时B组、C组肾皮质P27的阳性强度均强于A组、D组(P<0.01),其中C组强于B组(P<0.01);D组强于A组(P<0.01);第12周时C组P27表达强度仍高于各组(P<0.01),而B组和D组无明显差异(P>0.01)。结论:1. megsin在糖尿病小鼠肾组织中表达增强,与肾脏系膜细胞增殖、肾脏肥大及肾功能受损程度相一致,提示megsin在糖尿病肾病的发生发展中起一定作用。2.过表达megsin糖尿病小鼠肾组织中P27表达明显增强,较单纯糖尿病小鼠肾脏系膜细胞增生、肾小球肥大,及肾功能受损程度明显加重,提示megsin通过上调P27表达促进肾小球肥大,可能是其参与糖尿病肾病病变过程的机制之一。3.通过megsin siRNA质粒转染证实,megsin低表达状态下,肾组织P27表达减弱,且肾小球肥大及肾功能受损程度减轻,提示抑制megsin的表达是早期防治糖尿病肾病的有效途径,为探索防治糖尿病肾病的措施提供了科学根据。