金磁纳米粒子的聚合物功能修饰及磁诱导体外转染研究

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基因治疗是基于基因重组的基因工程技术,能够纠正或者补偿因基因缺陷或者异常引起的顽固型疾病,如遗传性疾病和癌症,在临床应用中具有巨大的潜力和广泛的应用前景。基因载体能否安全、高效地携带治疗基因进入靶细胞,并且使基因在细胞中得到稳定可控的表达是基因治疗的关键。研究发现,利用磁性纳米粒子的磁性诱导可快速将载体富集到癌组织的周围,进一步提高基因治疗的效果。但是磁性纳米粒子在生物体内存在不稳定且难以功能化等缺陷。本文首先制备了金包磁的纳米粒子 Au@Fe3O4,用于提高磁性纳米粒子的稳定性和可修饰性,然后以嵌段聚合物聚乙二醇单甲醚-b-聚1-(3-胺丙基)-3-(2-甲基丙烯酰氧丙基)咪唑溴(PEG-b-PAMPImB)通过 Au-S键功能化 Au@Fe3O4,验证磁性诱导对其转染效率的影响。结果表明,在外加磁场作用下,聚合物功能化的金磁纳米颗粒PEG-b-PAMPImB-Au@Fe3O4转染效率得到明显提高。  1.核壳型金磁纳米粒子Au@Fe3O4的制备  化学共沉淀的方法制备 Fe3O4磁性纳米颗粒,采用直接还原的方法将氯金酸还原在磁性纳米颗粒的表面:分别以两种不同的还原剂柠檬酸三钠(Trisodium citrate,TSC)和硼烷叔丁胺(BTBA)制备金磁纳米粒子,得到TSC-Au@Fe3O4和 BTBA-Au@Fe3O4。并制备一系列 Fe3O4与 HAuCl4摩尔比不同的金磁纳米粒子,对其稳定性及磁响应性进行对比。外加磁场对金磁纳米粒子进行磁性分离,证明 Au@Fe3O4的磁响应性;透射电子显微镜(TEM)及晶体衍射证实 TSC-Au@Fe3O4和 BTBA-Au@Fe3O4的粒径较为均一,在20nm左右。对比不同摩尔比的Au@Fe3O4的颜色与紫外吸收光谱(UV),Fe3O4摩尔比减小时,颜色逐渐接近金纳米溶液的颜色,同时磁性分离的时间增加,紫外吸收光谱分别测得的特征吸收峰随着摩尔比的减少发生红移,这些都与理论上壳层 Au厚度的增大相一致。  2. PEG-b-PAMPImB-Au@Fe3O4体外转染研究  取上述制备的 BTBA-Au@Fe3O4,将嵌段共聚物 PEG-b-PAMPImB通过金硫键接枝在 Au的表面,得到 PEG-b-PAMPImB-Au@Fe3O4。外加磁场及紫外吸收光谱( UV)表征金包磁纳米颗粒的合成;PEG-b-PAMPImB-Au@Fe3O4与质粒DNA(pEGFP-C1)以不同的比例复合,琼脂糖凝胶电泳实验测定复合比例;透射电子显微镜(TEM)及动态光散射(DLS)表征聚合物金磁纳米颗粒及其复合物的粒径及形态;MTT法测定金磁纳米粒子载体在有磁场和无磁场作用下的细胞毒性,在有效孵育时间内(4h),外加磁场并没有增大金磁纳米粒子载体的细胞毒性;PEG-b-PAMPImB-Au@Fe3O4与 pEGFP-C1复合,对其复合物在人食管癌细胞系(EC109)中的转染效率进行了研究,分别在有外加磁场和无外加磁场的情况下,通过荧光显微镜及激光扫描共聚焦观察pEGFP-C1基因的表达效果:结果表明,pEGFP-C1的体外细胞转染效率仍依赖于复合物的 N/P比,这与其他非病毒类基因载体相一致;在有外加磁场和不加磁场两种情况下均能够递送DNA进行转染,外加磁场作用下的转染效率高于无外加磁场的效率,磁诱导效果显著;与嵌段共聚物相比,磁诱导效应还可以使 PEG-b-PAMPImB-Au@Fe3O4在较低的N/P比时就有较高的转染效率。
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