炎症是一种非常常见而又重要的基本病理过程,动脉粥硬化、高血压、癌症等疾病与炎症息息相关。因此研发出具有高效且副作用小的抗炎药具有重要的现实意义。花生四烯酸是多种炎症物质的前体。正常生理情况下,花生四烯酸主要以磷脂的形式存在于细胞膜上,无生物活性;极少量的花生四烯酸以游离形式存在。当细胞膜受到各种刺激时,游离的花生四烯酸从细胞膜磷脂池中释放出来,通过各种途径转化为有生物活性的代谢产物。环氧化酶途径和脂氧合酶途径是花生四烯酸代谢中两条重要的途径。环氧化酶在生物体内以两种形式存在,分别是结构型环氧化酶-1和诱导型环氧化酶-2,前者参与维持机体内正常的生理功能;后者在正常生理情况下无法检出,但在炎性细胞和癌细胞中大量表达。5-脂氧合酶广泛存在于动物体内,正常生理情况下不表达,在炎症及癌症相关的细胞中高表达。环氧化酶-2/5-脂氧合酶双重抑制剂能够阻断两条代谢通路,抑制炎症介质前列腺素和白三烯的生成,达到良好抗炎作用的同时避免环氧化酶抑制剂引发的副作用。本研究拟利用Autodock4.2计算出5-脂氧合酶和抗5-脂氧合酶阳性抑制剂间的结合自由能,建立抑制剂结合自由能(△G)与生物活性p IC50之间的关系模型,并利用此模型和分子对接结果从中药一点红中筛选出具有抗5-脂氧合酶活性的优选化合,并结合本课题组一点红中化合物与环氧化酶-2对接结果,从中筛选出对5-脂氧合酶和环氧化酶-2具有双重抑制作用的优选化合物。再通过5-脂氧合酶抑制剂验证模型-比色法对具有双重抑制作用的优选化合物进行验证,并对一点红提取部位进行筛选。进一步利用反相高效液相色谱法对一点红及一点红抗炎活性部位进行指纹图谱研究,为一点红药材及其抗炎活性部位药物制剂质量控制提供依据。结果表明,7种抗5-脂氧合酶抑制剂(木犀草素、白皮杉醇、表儿茶素、齐留通、利克飞龙、CHEMBL367188、2-{2-Oxo-2-[1-(toluene-4-sulfonyl)-1H-indol-3-yl]-acetylamino)-acetic acid)结合自由能(Y)与5-脂氧合酶抑制活性p IC50(X)的关系模型为:Y=-3.2983-0.72431X,R~2=0.93845,p=0.014,σs=0.29551,P值和标准误差都在可接受的范围。根据该模型及一点红中123种化学成分与5-脂氧合酶对接结果,从中筛选出33种抗5-脂氧合酶化合物。并结合本课题组一点红中化合物与环氧化酶-2对接结果,从中筛选出8种优选化合物对5-脂氧合酶和环氧化酶-2具有双重抑制作用,8种化合物分别是咖啡酸、3,4-二羟基苯乙酸、4-羟基苯乙酸、鼠李素、槲皮素、木犀草素、Tau.muurolol、α-雪松烯。分析一点红中优选化合物与5-脂氧合酶结合模式,发现:羧酸类化合物对5-脂氧合酶具有良好的抑制作用。该类化合物可与5-脂氧合酶良好的结合,但脂肪族和芳香族羧酸与5-脂氧合酶结合作用机制不同。脂肪族羧酸与5-脂氧合酶结合力主要由静电力提供,芳香族羧酸与5-脂氧合酶结合的主要驱动力是范德华力。以利克飞龙(ML-3000)为阳性对照,利用5-脂氧合酶抑制剂验证模型-比色法对6种可获得的优选化合物(咖啡酸、3,4-二羟基苯乙酸、4-羟基苯乙酸、鼠李素、槲皮素、木犀草素)进行5-脂氧合酶抑制活性验证。得到这六种优选化合物的半抑制浓度分别为0.8871μg/m L、3.613μg/m L、6.01μg/m L、9.132μg/m L、2.201μg/m L、2.105μg/m L,阳性抑制剂ML-3000的半抑制浓度为10.851μg/m L。用75%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇作为溶剂提取得到一点红的不同提取部位,将一点红各提取部位配制成1mg/m L溶液,通过比色法测定一点红不同部位对5-脂氧合酶的抑制活性。结果表明,除石油醚部位外,其余各部位对5-脂氧合酶均有抑制作用。各部位对5-脂氧合酶抑制率分别为27.3±1%、58.2±1.8%、54.7±0.6%。分别通过超声波细胞粉碎0min、30min、60min、120min,考察了对乙醇、乙酸乙酯、正丁醇提取率及对5-脂氧合酶抑制率的影响,表明随着超声时间的延长,石油醚、乙醇、乙酸乙酯部位提取率逐渐增大但抗5-脂氧合酶活性逐渐下降,正丁醇部位几乎无影响。进一步建立10个批次一点红药材以及一点红乙酸乙酯部位HPLC指纹谱图,并利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”对其进行相似度评价,结果表明一点红药材及其乙酸乙酯部位指纹图谱相似度分别在0.89和0.91以上。通过比较对照品的液相保留时间,乙酸乙酯部位指纹图谱7个峰被确认:4-羟基苯乙酸、咖啡酸、4-羟基苯甲酸、槲皮苷、木犀草素、槲皮素、鼠李素。