小窝介导的功能化磷酸钙纳米粒的构建及其基因转染特性研究

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目的:  为解决传统磷酸钙纳米粒基因转染效率低、稳定性差、难以实现体内转染等问题,本文在磷酸钙纳米粒的基础上,设计构建了两类可以刺激小窝依赖的内吞途径并通过该途径入胞的新型功能化基因递送系统。第一类是以传统磷酸钙纳米粒为基因压缩材料,利用BSA可以与细胞表面结合,刺激小窝蛋白-1(CAV1)的磷酸化从而促进小窝的产生和释放来介导小窝依赖的内吞途径的独特性质,设计构建了通过小窝介导的内吞途径入胞的生物蛋白冕功能化修饰的基因载体系统。以期通过 BSA生物蛋白冕的引入特异性地刺激小窝介导的内吞,控制传统磷酸钙纳米粒的入胞和转运途径,降低网格蛋白介导的内吞途径引起的在内含体和溶酶体中的基因降解,并增加其稳定性和生物相容性。第二类是设计合成甘露醇修饰的偕二膦酸衍生物(MA-AL),通过偕二膦酸基团与Ca2+的配位作用,将MA-AL修饰于磷酸钙纳米粒表面。通过MA-AL激活小窝蛋白-1的磷酸化,增加纳米粒通过小窝介导的内吞途径入胞,避免负载基因在内含体和溶酶体的降解,从而减少传统磷酸钙纳米粒主要经过网格蛋白介导的内吞途径入胞导致的基因降解。同时,通过多羟基衍生物MA-AL的引入增加纳米粒的稳定性,以期得到转染效率高、稳定性好、可用于体内基因转 空军军医大学硕士学位论文  染的基因递送系统。  方法:  1、以传统磷酸钙纳米粒为DNA压缩材料,通过BSA与Ca2+之间的静电吸附作用,采用两种方法制备了4个不同重量比的两类共8种BSA修饰的有机-无机杂化磷酸钙纳米递送系统BSA-CaP-5/15/30/50-M1和BSA-CaP-5/15/30/50-M2。  2、通过偕二膦酸基团与 Ca2+的配位作用,将甘露醇修饰的偕二膦酸衍生物MA-AL修饰于磷酸钙纳米粒表面,制备得到3种不同修饰度的功能化磷酸钙纳米递送系统CaP-MA-5、CaP-MA-20和CaP-MA-40。  3、采用纳米激光粒度测定仪对两大类递送系统的稳定性和zeta电位进行表征;通过核酸内切酶降解保护实验测定基因递送系统对质粒DNA的保护能力;采用溶血实验和MTT实验对两类递送系统的生物相容性进行评价;以编码绿色荧光蛋白的基因为报告基因,采用流式细胞术和荧光显微镜评价两类基因递送系统的基因转染活性;使用特异性内吞途径抑制剂对两类递送系统的入胞机制进行研究;通过Western-blot实验评价两类载体材料及其递送系统对小窝蛋白-1磷酸化的影响;利用荧光标记的DNA对第二类递送系统的细胞摄取行为进行研究;利用特异性分子探针对第二类载体材料的胞内行为进行研究;以编码绿色荧光蛋白的基因为报告基因,评价两类递送系统的体内基因转染活性。  结果:  一、BSA修饰的有机-无机杂化磷酸钙纳米粒  1、采用两种制备方法,在 4个不同重量比下制备得到 BSA-CaP-5/15/30/50-M1和BSA-CaP-5/15/30/50-M2共8种有机-无机杂化纳米粒。纳米激光粒度仪测定结果显示,制备方法1所得BSA-CaP-M1纳米粒的粒径在181-411 nm之间,制备方法2所得BSA-CaP-M2纳米粒的粒径在113-359 nm之间,且随着BSA/CaP比值增大纳米粒粒径减小。zeta电位测定结果表明,两类纳米粒均荷负电。透射电镜观察结果显示,纳米粒呈类球型,粒径均一,分散性良好。核酸内切酶降解保护实验结果表明,两类纳米粒均具有良好的DNA保护性能。稳定性实验结果显示BSA-CaP-M1/M2纳米粒稳定性较传统磷酸钙纳米粒而言有明显提高。  2、MTT实验结果显示,BSA-CaP-M1/M2两类纳米递送系统安全性良好,较传统磷酸钙纳米粒而言,其细胞毒性明显降低。溶血实验结果表明,BSA-CaP-M1/M2纳米粒溶血率均小于5%,符合生物材料安全性要求。  3、体外基因转染实验结果表明,与磷酸钙纳米粒相比,两种制备方法所得BSA-CaP-M1/M2 纳米粒的转染效率均有明显提高。其中BSA-CaP-50-M2 纳米粒的阳性转染百分数和平均荧光强度最高。  4、不同入胞途径特异性抑制剂存在下的基因转染实验结果显示,加入巨胞饮途径抑制剂阿米洛利时,磷酸钙纳米粒和BSA-CaP-50-M2纳米粒的转染效率均不受影响;加入网格蛋白介导的内吞途径抑制剂氯丙嗪时,磷酸钙纳米粒的转染效率明显降低,而BSA-CaP-50-M2纳米粒的转染效率仅在高浓度下有轻微降低;加入小窝介导的内吞途径抑制剂金雀异黄酮时,磷酸钙纳米粒的转染效率有所降低,而BSA-CaP-50-M2 纳米粒的转染效率则明显降低。上述结果表明,磷酸钙纳米粒的入胞方式为网格蛋白和小窝介导的内吞途径,但主要依赖于网格蛋白介导的途径。而BSA-CaP-50-M2纳米粒主要通过小窝介导的内吞作用入胞。  5、Western-blot实验结果表明,BSA及其修饰的BSA-CaP-50-M2纳米递送系统具有上调小窝蛋白-1(CAV1)磷酸化水平的能力,可刺激细胞高水平地表达磷酸化的小窝蛋白-1(P-CAV1)。当加入抑制剂金雀异黄酮时,P-CAV1的表达显著下调。以上结果显示,BSA蛋白冕修饰的BSA-CaP-50-M2杂化纳米粒可保留BSA固有的入胞机制,刺激小窝蛋白-1 的磷酸化,激活小窝介导的入胞途径,从而改变磷酸钙纳米粒的细胞摄取路径。  6、体内基因转染实验结果显示,BSA-CaP-50-M2载基因纳米粒在体内可以成功递送DNA,单次给药可实现至少72小时的基因转染效果。  二、甘露醇-偕二膦酸衍生物修饰的功能化磷酸钙纳米粒  1、设计合成了甘露醇-偕二膦酸衍生物MA-AL,核磁共振氢谱、红外光图谱鉴定结果表明,所得产物MA-AL的结构与目标产物一致。  2、采用共沉淀法可方便地制得不同程度甘露醇化的 CaP-MA-5/20/40 三种纳米粒。纳米粒稳定性研究发现,上述纳米粒的稳定性较传统磷酸钙纳米粒而言有明显的提高,CaP-MA-20/40纳米粒的粒径在放置5天后仍没有明显变化。扫描电镜观察结果显示,纳米粒呈类球型,粒径均一。核酸内切酶降解保护实验结果表明, CaP-MA-5/20/40纳米粒均具有良好的DNA保护性能。  3、MTT 实验结果显示,与传统磷酸钙纳米粒相比,CaP-MA-5/20/40 纳米粒细胞毒性明显降低。溶血实验结果表明,CaP-MA-5/20/40纳米粒溶血率均小于5%,符合生物材料安全性要求。  4、体外基因转染实验发现,上述3种功能化纳米粒都表现出较高的转染效率,且均优于磷酸钙纳米粒。其中,CaP-MA-40 纳米粒表现出最优的阳性转染百分数和平均荧光强度。  5、不同入胞途径特异性抑制剂存在下的转染实验结果发现,巨胞饮途径抑制剂阿米洛利存在条件下,磷酸钙纳米粒和CaP-MA-40纳米粒的转染效率均不受影响;网格蛋白介导的内吞途径抑制剂氯丙嗪存在条件下,磷酸钙纳米粒转染效率明显降低,而CaP-MA-40纳米粒转染效率的降低幅度远小于磷酸钙纳米粒;小窝介导的内吞途径抑制剂金雀异黄酮存在条件下,磷酸钙纳米粒转染效率的降低幅度显著低于CaP-MA-40纳米粒,初步表明MA-AL修饰的CaP-MA-40纳米粒对金雀异黄酮(小窝介导的内吞途径抑制剂)的敏感性显著提高。  6、不同入胞途径特异性抑制剂存在条件下的摄取实验发现,巨胞饮途径抑制剂的加入对传统磷酸钙纳米粒和功能化CaP-MA-40纳米粒的摄取没有影响。流式细胞术分析结果显示,当用网格蛋白介导的内吞途径抑制剂或小窝介导的内吞抑制剂处理细胞时,磷酸钙纳米粒的摄取分别被抑制了57.6%或28.3%。而CaP-MA-40纳米粒的摄取则相应减少了11.5%或63.8%。激光扫描共聚焦显微镜观察的细胞摄取结果与流式细胞术分析结果一致。  7、纳米粒的胞内亚细胞器共定位研究结果显示,磷酸钙纳米粒与溶酶体显示出极高的共定位水平,入胞后主要进入溶酶体中。CaP-MA-40 纳米粒与磷酸钙纳米粒相比,进入溶酶体中的量明显减少,主要进入小窝体中。这些结果表明未修饰的磷酸钙纳米粒主要通过网格蛋白介导的途径摄取并转移到溶酶体中,且MA-AL的引入可刺激小窝介导的内吞作用,增加小窝途径的细胞摄取。  8、Western-blot 实验结果表明,MA-AL 衍生物及其所修饰的纳米粒具有激活CAV1磷酸化的作用,可刺激P-CAV1的表达。CaP-MA-40纳米粒可显著上调P-CAV1的表达,而未修饰的磷酸钙纳米粒对P-CAV1的表达没有明显影响。当加入抑制剂金雀异黄酮后,CaP-MA-40纳米粒激活CAV1磷酸化的水平得到明显抑制。  9、体内基因转染实验结果表明,CaP-MA-40在四种纳米递送系统中显示出最高的荧光强度,远高于磷酸钙纳米粒。CaP-MA-40 载基因纳米粒单次给药后能够在体内转染至少72小时,可实现持续的转基因表达。  结论:  本论文设计构建了两大类共 11 种基于磷酸钙的新型功能化磷酸钙纳米递送系统。两类基因载体均能通过刺激P-CAV1的表达,控制传统磷酸钙纳米粒的入胞和转运途径,促进小窝介导的入胞摄取,从而展现出良好的体内外基因转染活性。通过进一步的研究,可望为遗传性或获得性疾病以及军队战创伤相关疾病的基因治疗提供新型高效的递送系统。
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