目前世界结核病的形势依然十分严峻,而耐药性结核病正处于创纪录水平.卡介苗(BCG)是目前世界上唯一可应用的抗结核疫苗,但其效果呈现一个较大范围(0%-85%)的波动,且不能预防成人型肺结核。与传统疫苗相比,基因疫苗有其独特的优点,然而单独基因疫苗所引起的效应并不比卡介苗显著。现在有很多实验应用了:一种表达免疫调节因子的质粒,另外一种表达病原体的保护性抗原的质粒,这两个质粒同时免疫给动物身上,想要通过细胞因子的佐剂作用和免疫调节作用去提高和增加动物体内的特异性免疫应答反应,产生高效的免疫保护结果。Ag85A是结核分枝杆菌及BCG分泌的蛋白成分之一,能诱导强烈的细胞免疫反应。不断发展后天获得的细胞免疫对控制结核病是十分关键的。而细胞免疫的关键细胞因子是IFN-γ,能够刺激感染的巨噬细胞诱导产生吞噬溶酶体并杀死细胞内的细菌。IL-12和IL-18是DC细胞产生的、诱导Thl型细胞增殖分化的关键细胞因子,人类和小鼠因缺乏IL-12的P40链或者受体,故对结核菌有高度易感性。表达IL-12或IL-18的质粒已经在几个感染模型中作为佐剂使用。同时给予表达IL-12或IL-18的质粒增强了Ag85B DNA疫苗的IFN-γT细胞反应,但是仅仅表达IL-12的质粒增强了保护效应。本篇实验研究使用结核分枝杆菌的保护性的抗原:Ag85A的基因真核表达质粒了,与人IL-12(PORF-hIL-12)的真核表达质粒一起去同时免疫小鼠,观察这两者在小鼠身上所诱导出来的的细胞免疫。目的:构建一种编码结核分枝杆菌的Ag85A分泌蛋白真核表达质粒,观察其与人白细胞介素12(hIL-l2)联合免疫小鼠后的细胞免疫应答。方法:1.构建质粒:采用PCR法从H37Rv菌株中扩增出Ag85A的编码基因,用限制性的内切酶消化后,插入到克隆载体PMD20-T中,经酶切鉴定、序列测定证实后,再以亚克隆法连接于真核表达载体PCDNA3.1的相应酶切位点。2.动物实验:50只C57BL/6N小鼠随机分为:①Ag85A基因疫苗+hIL-12质粒组(联合免疫组);②Ag85A基因疫苗组;③BCG组(阳性对照);④空载体组(阴性对照);⑤PBS组(空白对照)。基因疫苗、空载体和PBS经肌肉内注射法免疫各组小鼠,每隔3周免疫1次,一共免疫3次;BCG组经尾部皮下注射1×106 CFU BCG免疫1次,每只注射约0.3ml。等到第三次免疫小鼠后的28天,处死各组小鼠,分离脾细胞,再用ELISA法检测脾细胞的培养上清液中IFN-γ、IL-2、IL-4水平;乳酸脱氢酶释放法检测脾细胞的杀伤活性;分离的脾细胞经TB-PPD刺激后,XTT比色法检测脾淋巴细胞的增殖活性。结果:1.成功构建了结核分枝杆菌Ag85A基因的DNA疫苗。2.联合免疫组能够诱导出比较强烈的抗原特异性Thl型细胞免疫,免疫小鼠的脾细胞培养上清液中IFN-γ和IL-2水平显著高于Ag85A基因疫苗组,与BCG组相当,而IL-4分泌减少;特异性CTL的杀伤活性明显增强了;淋巴细胞的增殖活性也明显高于了其他的组别。结论:hlL-12质粒能够增强结核分枝杆菌Ag85A基因DNA疫苗所诱导的小鼠细胞免疫应答。