目的类风湿关节炎(RA)是一种慢性、全身性的自身免疫性疾病,以慢性炎症和滑膜增生为主要特征。越来越多的证据表明,除了巨噬细胞和T细胞,活动性类风湿关节炎的成纤维样滑膜细胞(FLSs)在类风湿关节炎的始发和发展中发挥主要作用,包括血管翳形成,促炎因子的分泌,新生血管生成和软骨退化。在动物模型中,在RA的慢性期滑膜组织学检查显示了明显增生的梭形滑膜细胞群。高度转化的滑膜细胞即有大苍白核与显著核仁大量出现,尤其是在滑膜浸润/关节周围骨侵蚀的部位。在显微镜检查中的增殖标记Ki67证实增殖的滑膜细胞聚集在滑膜衬里层。RAFLSs的快速增殖和凋亡缺陷是滑膜增生的两大主要机制。有研究指出,RAFLSs能快速的改变凋亡相关分子如p16,SENTRIN,和PTEN分子水平。因此,因此,RAFLSs在具有潜在的高增殖能力和细胞内的分子失调性表达方面类似于恶性细胞,其可以调节细胞周期和细胞凋亡。小檗碱又名黄连素,是黄连的主要成分,有多种药理活性,包括抗菌活性,抗肿瘤和抗血小板聚集。越来越多的证据表明在动物模型实验及其他试验系统中小檗碱具有抗炎的作用。例如,在一个自身免疫性肾小管间质肾炎模型实验,小檗碱被发现能有效的降低小鼠病理损伤强度并且在此模型有免疫抑制作用。它已经表明,小檗碱能抑制迟发型超敏反应(DTH)。有意思的是,小檗碱也显示可以减轻佐剂性关节炎大鼠的临床症状。然而,小檗碱对类风湿关节炎的抑制作用机制尚未完全阐明。在本研究中,我们研究了小檗碱对体外培养的人RAFLSs的作用,并深入阐明了小檗碱在其中的作用机制,对类风湿关节炎的治疗具有潜在的应用价值。方法1.小檗碱对人RAFLSs细胞增殖的影响(1)RAFLSs原代细胞的培养：RAFLSs细胞取自39例进行全关节置换手术的类风湿关节炎病人。类风湿关节炎的诊断标准参考ACR1987修订标准。手术中得到的滑膜组织剪成很碎的小块之后,用胶原酶消化,得到细胞悬液进行培养。用流式细胞仪检测RAFLSs细胞的纯度(>95% CD90+,<2% CD14+, <1% CD3+, and<1% CD19+)。(2)采用不同浓度的小檗碱处理RAFLSs细胞,作用不同时间之后,用MTT法检测细胞增值率。2.小檗碱对RAFLSs细胞周期的影响(1)采用不同浓度的小檗碱处理RAFLSs细胞后,利用细胞周期检测试剂盒通过PI染色检测细胞周期的变化。(2)采用western-blot的方法检测细胞周期蛋白激酶Cdk2, Cdk4, Cdk6,细胞周期蛋白激酶抑制分子p21,p27,细胞周期蛋白cyclin D1, cyclinD2和cyclin E的表达的变化。3.小檗碱对RAFLSs细胞凋亡的影响(1)采用不同浓度的小檗碱处理RAFLSs细胞后,利用AnnexinⅤ-FITC/PI双染法,流式细胞术检测小檗碱对细胞凋亡的影响。(2)采用western-blot的方法检测细胞凋亡相关分子Bax, Bcl-2, Bcl-xl, PARP的表达情况。(3)采用JC-1染料,流式细胞术检测小檗碱对细胞线粒体膜电位的变化。(4)采用caspase-3和caspase-9活性检测试剂盒检测小檗碱对caspase-3和caspase-9活性的影响。结果1.小檗碱抑制人RAFLSs细胞增殖为了确定小檗碱对RAFLSs细胞增殖的影响,我们加入不同浓度的小檗碱于RAFLSs细胞培养液中,孵育不同时间之后,用MTT法检测细胞的增殖率。我们的结果显示小檗碱能明显的抑制RAFLSs细胞增殖,并且具有浓度和时间依赖性。2.小檗碱诱导人RAFLSs细胞G0/G1期阻滞。为了研究小檗碱抑制RAFLSs细胞增殖的机制,我们检测了小檗碱对RAFLSs细胞周期的影响。我们发现RAFLSs细胞经过小檗碱处理之后,G0/G1期细胞明显增多,S和G2-M期细胞减少,提示我们小檗碱可能是通过诱导G0/G1期细胞阻滞来抑制细胞增殖的。我们进一步检测了调控细胞周期的蛋白表达,结果显示小檗碱处理RAFLSs细胞后,诱导细胞周期从G0/G1期到S期的细胞周期蛋白激酶Cdk2, Cdk4和Cdk6表达明显降低,而它们的抑制剂p21和p27表达明显上调,这种作用在高浓度的小檗碱作用下尤其明显。此外,促进细胞周期进程的蛋白cyclin D1, cyclinD2和cyclin E在小檗碱的作用下也表现出剂量依赖性的表达下调。这些结果指出,小檗碱能够通过作用于细胞周期蛋白及其激酶进而诱导细胞周期阻滞来抑制RAFLSs细胞增殖。3.小檗碱诱导人RAFLSs细胞凋亡为了研究小檗碱抑制RAFLSs细胞增殖和诱导G0/G1期阻滞可以导致RAFLSs细胞凋亡,我们采用AnnexinⅤ-FITC/PI双染法来检测小檗碱对RAFLSs细胞凋亡的影响。结果显示小檗碱能够明显的诱导RAFLSs细胞凋亡,并且具有剂量依赖性。我们进一步检测了凋亡相关蛋白Bax, Bcl-2, Bcl-xl的表达,结果显示小檗碱作用之后,促凋亡蛋白Bax的表达上调,抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的表达下调。另外,RAFLSs细胞经过小檗碱处理之后,线粒体膜电位失衡,caspase-3, caspase-9和PARP的活化明显增强。所有这些结果显示,小檗碱可以通过作用于线粒体凋亡通路进而诱导RAFLSs细胞发生凋亡。结论：1.小檗碱能够显著的抑制RAFLSs的细胞增殖能力。2.小檗碱能使RAFLSs细胞周期阻滞在G0/G1期,并且具有浓度和时间依赖性。小檗碱对细胞周期的这种阻滞作用是由于对细胞周期蛋白激酶抑制剂p21和p27的诱导和对细胞周期蛋白激酶CDK2, CDK4, CDK6,细胞周期蛋白cyclin D1,cyclinD2,和cyclin E的抑制。3.小檗碱处理细胞能诱导RAFLSs细胞凋亡。小檗碱通过促凋亡蛋白Bax的表达上调,抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的表达下调,线粒体膜电位的失衡,caspase-3, caspase-9和PARP的活化等机制诱导RAFLSs凋亡。创新性和意义：在本研究中,我们首次发现小檗碱能够抑制RAFLSs的增殖,其机制主要是小檗碱可以诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡,对类风湿关节炎的治疗具有重要的理论价值和潜在的临床应用价值。局限性对小檗碱在体内是否还具有同样的作用需要进一步验证。