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大肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，近年来大量统计资料表明，我国的大肠癌发病率和死亡率呈逐年增高。在临床上大肠癌根治性切除后出现肝转移是导致死亡的主要原因。因此，早期预测和诊断肝转移是提高大肠癌生存率的关键，对改善大肠癌预后有重要意义。蛋白质组学研究方法和技术为大肠癌肝转移分子机制及早期诊断和防治的研究提供了有利条件。【目的】 利用蛋白质组研究技术,通过双向电泳分离、比较大肠癌原发灶、正常大肠粘膜、大肠癌肝转移灶中蛋白质表达差异，通过质谱检测分析，确定与大肠癌肝转移相关的蛋白质组分。探讨大肠癌肝转移的分子机制，寻找和鉴定大肠癌肝转移相关蛋白，为临床预测和早期诊断大肠癌肝转移提供依据。【方法】 （1）分别采用一步法、分步法提取大肠癌原发灶、肝转移灶、正常肠粘膜组织蛋白质组；（2）以Bradford测定法绘制蛋白定量标准曲线，对各组织样品蛋白提取物定量；（3）各组织蛋白质组提取物以相同加样量行双向凝胶电泳：一向等电聚焦，使用固相pH梯度凝胶条（IPGstrip pH3-10L），胶内重泡胀技术，聚焦总电压时35kVh～40kVh；用高效去垢剂三正丁基膦（TBP）一步平衡；二向电泳采用十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（12.5%、1.5mm均一胶）；（4）染色：行银染和考马斯亮蓝染色；（5）图象采集与分析：将双向电泳图谱输入计算机，使用Melanie3.0双向电泳图象分析软件分析，比较分步提取法与一步法差异：以正常大肠粘膜组织行对照、斑点配比，评价双向电泳重复性。（6）大肠癌肝转移蛋白质组表达差异分析，确认差异表达蛋白点；（7）肽质量指纹分析：差异蛋白点经基质辅助解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TF-MS）分析，获得肽质量指纹谱。使用基质峰和胰蛋白酶自动降解离子峰作为内部标准校正，以Profound检索程序在NCBInr数据库中进行蛋白同源查询，结合双向凝胶电泳相应点表观等电点、分子量、匹配肽段和覆盖率等进行综合分析。【结果】 （1） 大肠癌原发灶、正常肠粘膜、肝转移灶组织样品第二步提取物蛋白定量结果分别为2.5μg/μl、2.7μg/μl、2.3μg/μl，符合双向电泳要求；一步法提取物三种组织浓度分别为1.2μg/μl、1.3μg/μl、1.5μg/μl。分步合成<WP=8>胶图谱蛋白点检测平均为765.75，一步法平均为522.75，两者相差显著。（2） 经Melanie 3.0软件分析，重复性评价结果显示：总蛋白质的分布模式非常相似，蛋白质斑点数分别为266、207；蛋白点分子量介于8～90kD，等电点介于4～9；匹配率为72%，匹配点数190；匹配蛋白点量的相关系数为0.912；配对t检验结果P>0.05（t=1.97, P=0.56），差别不显著；位置重复性好。 （3） 蛋白质组差异表达与图象分析结果显示：相同条件下，大肠癌原发灶中蛋白质斑点为206±22个，正常肠粘膜组织中为390±28个，肝转移灶组织中为236±19个。大肠癌肝转移灶中蛋白质表达与癌原发灶、正常肠粘膜相比有显著差异（t=17.321、29.637, P<0.01）。不同组织蛋白质点与正常结肠粘膜参考胶蛋白质点匹配显示：正常肠粘膜组织为313±45个，癌原发灶为195±38个，肝转移灶为184±24个。平均匹配率分别为：80.3%、77.2%、78.0%。（4） 大肠癌原发灶、肝转移灶、正常肠粘膜的双向电泳有显著的蛋白质表达差异。在pH4.0-9.0范围内，癌原发灶和肝转移灶中25-40KD蛋白质表达表达缺失或下降较多。分子量为14-21KD的蛋白质在癌原发灶和肝转移灶中出现特异性表达或较正常肠粘膜表达量明显增加。（5） 对大肠癌原发灶、肝转移灶、正常肠粘膜组织组织中9个差异表达蛋白点分析鉴定，钙调蛋白联合体、核糖核酸酶-6-前体蛋白以及XP040720蛋白在正常肠粘膜表达，但肝转移和癌原发灶中表达缺失。前阿朴脂蛋白在正常肠粘膜中表达缺失，而在癌原发灶及肝转移灶中表达递增。C-4蛋白点肽指纹与已知蛋白比较同源性低，在癌原发灶中表达，在肝转移灶和正常肠粘膜中为阴性。β-珠蛋白在肝转移灶和正常肠粘膜中表达，而在癌原发灶中表达缺失。M-7、M-9蛋白点和Cdc 42在肝转移灶中表达，在原发灶和正常肠粘膜未见表达。【结论】（1） 建立的分步提取法可以提高组织蛋白质组的提取率，减少常规一步提取法蛋白质的丢失，提高了分离效果，对蛋白质斑点的鉴别可提供更多的信息。（2） 应用固定pH梯度（IPG）及胶内重泡胀技术，可提高双向电泳的分辨率和重复性。（3） 对比大肠癌原发灶、肝转移灶、正常肠粘膜的双向电泳图象分析结果，表明在大肠癌发生和肝转移的过程中有显著的蛋白质表达差异。（4） 钙调蛋白联合体、核糖核酸酶－6－前体蛋白、α-甘露糖苷酶Ⅰ表达缺失与大肠癌发生和肝转移有关；前阿朴脂蛋白增强表达与大肠癌发生和转移有关；Cdc42蛋白、β-珠蛋白、表达与肝转移有关。（5） C-4、M-7、M-9蛋白可能是与大肠癌发生和肝转移相关的新蛋白，其序列和功能有待进一步研究。