论文部分内容阅读
农业生产上由真菌、细菌、线虫引起的植物病害的防治一直是非常重要的环节。多数病害的防治主要依赖于化学农药的使用,但化学农药的大量使用容易对环境造成污染,危害人畜健康,同时造成病原菌抗性不断上升。而生物防治对人畜安全,对环境污染极少,有时对某些有害生物可以达到长期抑制的作用,使用方便,便于利用,近年来受到了广大的关注。产酶溶杆菌OH11菌株是从土壤中分离的一个生防菌株,革兰氏阴性菌,对由真菌、细菌引起的许多病害都有生防作用。它GC含量高,有滑移性,能产生许多胞外水解酶,如几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、a-水解蛋白酶等,而酶的水解活性一直是生防菌株生防机制的重要研究内容之一。本研究根据已经报道的产酶溶杆菌生防基因的核酸序列进行分析,设计引物,从产酶溶杆菌OH11菌株基因组DNA中扩增出几丁质酶基因(chiA基因)、β-1,3-葡聚糖酶基因(gluA基因和gluC基因)和a-水解蛋白酶基因(a-lytic protease基因),并克隆到表达载体pET21a(+)或pET30a(+)上。挑选阳性克隆,分别命名为BLChiA、BLGluA、BLGluC、BLaLP并测序。测序后发现OH11菌株中chiA基因与C3菌株和N4-7菌株的chiA基因在氨基酸水平上分别有97.24%和95.93%的同源性,96.85%和95.74%的相似性。β-1,3-葡聚糖酶基因中gluA基因与C3菌株和N4-7菌株的gluA基因在氨基酸水平上分别有98.06%和94.57%的同源性,96.77%和94.57%的相似性;gluC基因与C3菌株和N4-7菌株的gluC基因在氨基酸水平上分别有97.42%和96.12%的同源性,96.99%和95%的相似性。a-水解蛋白酶基因与菌株ATCC 29487和菌株ATCC 29478的a-水解蛋白酶基因在氨基酸水平上分别有90.77%和91.02%的同源性,92.93%和92.68%的相似性。将表达菌株大量培养,IPTG诱导后进行15%SDS-PAGE检测,压力破碎细胞后用Ni2+柱纯化蛋白,将纯化后的蛋白作水解圈和抑菌圈实验发现纯化的蛋白均能产生水解圈,对水稻纹枯病菌菌丝的生长有抑制和水解效应。