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目的血脑屏障的存在,使常规的HIV-1治疗药物无法进入大脑,脑内HIV感染的治疗成为本领域的难点。本课题拟构建抗HIV-1新型多肽药物,该候选药物将能靶向脑组织,同时保留HIV-1进入抑制剂活性,实现“靶向-抑制”的双重功效,最终获得一种能有效阻断HIV脑部感染的新型HIV治疗药物,进一步为HIV治疗及脑潜伏库的清除奠定基础。方法1.靶向多肽的设计:首先通过参考大量文献,设计一系列包括不同氨基酸组成和长度的连接子(linker),将“脑靶向”多肽Angiopep-2与第三代HIV进入抑制剂T1144进行连接,由苏州金唯智生物科技有限公司合成我们所需要的融合蛋白。2.靶向多肽的原核表达与纯化:将目的片段与表达载体p GEX-6P-1-PDI和p ET-28a分别连接,在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中表达重组质粒,确定最佳表达条件。将表达成功的蛋白进行包涵体的变性和复性,最终通过镍柱纯化,Western Blotting检测纯化后的蛋白样品,回收蛋白备用。3.HIV检测模型的构建及鉴定:构建质粒PAAV-TRES-GFP-SC422,抽提备用。培养293T细胞和靶细胞TZM-b1,分别转染两个质粒,制备293T/PAAV-GFP-SC422和293T/PAAV-GFP的细胞悬液,在提前铺好的靶细胞TZM-b1中加入制备好的细胞悬液,不同时间点使用荧光显微镜的绿色荧光通道观察并记录细胞的融合情况,利用细胞-细胞融合模型,检测融合蛋白Ang-L6-T1144和T1144-L6-Ang对细胞-细胞融合模型的抑制作用。4.多肽抗细胞融合活性评价:合成多肽N36和C34,通过荧光非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(FN-PAGE)检测重组蛋白Ang-L6-T1144和T1144-L6-Ang是否可以干扰六螺旋结构束的形成,并进行剂量依赖实验。结果1.成功构建本实验所需的重组质粒,在大肠杆菌中表达质粒p GEX-6P-1-PDI-Ang-L35-T1144和p GEX-6P-1-PDI-T1144-L35-Ang,纯化失败。将p ET-28a-Ang-L6-T1144和p ET-28a-T1144-L6-Ang重组质粒在Rosetta(DE3)中进行原核表达,大部分表达在包涵体中,通过蛋白变性和复性,使用镍柱纯化成功。Western Blot转印凝胶的结果显示p ET-28a-Ang-L6-T1144和p ET-28a-T1144-L6-Ang的包涵体纯化产物仅分子量约为11 k Da的条带与单抗His结合。2.成功构建重组质粒PAAV-GFP-SC422,转染293T细胞,质粒在293T细胞中成功表达GFP,与阴性对照相比,经转染后的293T细胞与靶细胞TZM-b1共培养的结果显示,两种细胞融合4 h后,GFP重新分布,融合细胞变大,荧光变弱,48 h后形成肉眼可见的合胞体,成功构建细胞-细胞融合检测模型。当Ang-L6-T1144和T1144-L6-Ang融合蛋白的浓度分别达到30μM和5μM时,抑制细胞与细胞之间的融合均已超过90%。3.荧光非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(FN-PAGE)检测结果显示多肽N36和C34的混合物可形成六螺旋结构束,而无论Ang-L6-T1144和T1144-L6-Ang在N36和C34混合前后加入,均能抑制六螺旋结构的形成,当Ang-L6-T1144的浓度达到50μM、T1144-L6-Ang在浓度为12.5μM时,抑制了六螺旋结构束的形成。结论1.成功构建细胞-细胞融合检测模型的实验结果表明单个含有293T/SC422/EGFP的细胞与靶细胞TZM-b1共孵育可以发生融合,且在4 h的时候融合效率较好。2.Ang-L6-T1144和T1144-L6-Ang均能竞争性的与N36结合,抑制六螺旋结构的形成,且具有剂量依赖性。3.在HIV细胞-细胞融合检测模型的实验当中,Ang-L6-T1144和T1144-L6-Ang均能有效抑制细胞与细胞之间的融合,且T1144-L6-Ang的抑制效果优于Ang-L6-T1144。