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目的:
通过对鼠伤寒沙门菌脂多糖特异性适配体的截短设计,初步研究适配体的序列、结构与功能之间的关系;并将截短后的鼠伤寒沙门菌脂多糖特异性适配体修饰于聚丁二炔纳米囊泡表面,从而构建一种可以快速比色检测鼠伤寒沙门菌的适配体生物传感器。
方法:
1.聚丁二炔纳米囊泡的制备与表征:以PCDA单体、DMPC和鼠伤寒沙门菌脂多糖(LPS)为膜材,采用探头超声法制备三种不同体系的聚丁二炔纳米囊泡,分别是纯PDA囊泡、PDA/DMPC混合磷脂囊泡以及PDA/DMPC/LPS混合磷脂囊泡。采用透射电镜负染技术,对这三种囊泡进行形貌表征;采用紫外-可见光吸收光谱技术,对这三种囊泡进行特征吸收峰表征;采用鲎试验,对LPS是否插入囊泡及插入方向进行验证。
3.适配体-聚丁二炔纳米生物传感器的鼠伤寒沙门菌比色检测及于实际标本中比色检测鼠伤寒沙门菌:利用适配体与鼠伤寒沙门菌间特异性结合和结合后所引起的聚丁二炔纳米囊泡颜色变化和比色响应值(CR%)改变来定性或定量检测溶液中的鼠伤寒沙门菌。并通过激光共聚焦显微镜对适配体修饰的聚丁二炔纳米囊泡与鼠伤寒沙门菌之间的作用进行验证。利用适配体与鼠伤寒沙门菌间特异性结合和结合后所引起的聚丁二炔纳米囊泡颜色变化和比色响应值(CR%)改变来定性或定量检测实际标本中的鼠伤寒沙门菌。
结果:
1.聚丁二炔纳米囊泡的制备与表征:经透射电镜表征证实,纯PDA体系、PDA/DMPC混合磷脂体系以及PDA/DMPC/LPS混合磷脂体系均能形成囊泡,直径100nm左右以下;经254nm紫外线照射,各种体系均从无色转变为蓝色;经鲎试验证实,PDA/DMPC/LPS混合磷脂囊泡说明绝大部分LPS成功插入囊泡且LPS的特异多糖部分分布在囊泡表面。
2.鼠伤寒沙门菌脂多糖特异性适配体的截短设计与结合实验:经紫外-可见光吸收光谱分析证实,成功将适配体修饰到聚丁二炔纳米囊泡表面,其修饰效率大于80%;经ELISA方法和透射电镜负染技术,以及PDA/DMPC/LPS混合磷脂引起的适配体-聚丁二炔纳米生物传感器明显颜色变化和CR%增大等多项证实,成功获得具有结合鼠伤寒沙门菌功能的适配体截短序列。
3.适配体-聚丁二炔纳米生物传感器的鼠伤寒沙门菌比色检测于实际标本中比色检测鼠伤寒沙门菌:成功构建一种可以快速比色检测鼠伤寒沙门菌的适配体生物传感器,并经激光共聚焦显微镜证实。其不需要特殊仪嚣,操作简便,检测时间短,仅需3h;灵敏度较高检出限为105CFU/mL,线性范围为105~108CFU/mL;稳定性高,对107CFU/mL菌液检测的相对标准偏差(relativestandarddeviation,RSD)为5%;特异性强,不与伤寒沙门菌、甲型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌、大肠杆菌、宋内志贺菌、福氏志贺菌等反应。适配体-聚丁二炔纳米生物传感器:构建的快速比色检测鼠伤寒沙门菌的适配体生物传感器在检测粪便模拟阳性标本方面,虽然检测效率不如实验室模拟标本的程度,但趋势一致。本实验中还将制备的适配体生物传感器应用于实际临床标本的检测,阳性标本100%检出,在阴性标本检出结果中出现3%的假阳性结果,尚需改善标本预处理及再度提高传感器的抗干扰性。
结论:本研究成功获得具有结合鼠伤寒沙门菌功能的适配体截短序列,为进一步探索适配体的序列、结构与功能之间关系奠定基础;成功制备聚丁二炔纳米囊泡,并在其表面修饰鼠伤寒沙门菌特异适配体,构建鼠伤寒沙门菌适配体生物传感器,实现对鼠伤寒沙门菌的快速比色检测,为其他肠道病原菌的检测提供了宝贵的经验。