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目的:ALK阳性间变性大细胞淋巴瘤（ALCL）,作为非霍奇金淋巴瘤的一个特殊亚型,使用ALK/MET双靶点抑制剂克唑替尼（crizotinib）治疗有效。尽管治疗最初患者能极大获益,ALCL患者最终仍会发生对克唑替尼的耐药。肿瘤对ALK抑制剂的耐药是一个复杂且具有异质性的过程,耐药机制可能存在多种原因,ALK基因拷贝数目的扩增,ALK激酶区域突变以及信号旁路的激活等都可导致耐药。为了克服耐药,多种二代及三代ALK抑制剂和合理的药物联合策略被研究和使用。现有研究表明,IGF-1R（胰岛素样生长因子-1受体）在恶性肿瘤的发病机制中起重要作用,并且在ALK阳性间变性大细胞淋巴瘤中广泛表达。我们的前期研究发现,IGF-1R在ALK阳性间变性大细胞淋巴瘤克唑替尼耐药细胞中高表达。本研究的目的是,探讨IGF-1R信号通路活化和ALK激酶区域突变介导ALK阳性ALCL对克唑替尼的耐药机制。研究结果将为临床逆转克唑替尼耐药提供新的治疗选择。研究方法:1.采用逐步提高克唑替尼浓度的方法建立耐药细胞株;2.采用MTS法检测细胞的增殖活性;3.采用ELISA法检测细胞上清IGF-1的分泌水平;4.采用蛋白免疫印迹技术（Western Blot）检测蛋白表达;5.采用流式细胞术（AnnexinV/PI双染法）检测细胞凋亡;6.采用电穿孔法进行siRNA转染,敲减目的基因;7.采用Transwell法检测细胞迁移能力;8.统计学处理:每次实验结果均进行3次重复试验,使用SPSS version 21.0软件分析数据。数据均以均值±标准差（（?）±s）表示,组间差异进行t检验,P<0.05有统计学意义。结果:1.克唑替尼耐药细胞的构建及特征。ALK阳性ALCL细胞系Karpas299对克唑替尼高度敏感。为了探讨克唑替尼耐药的机制,通过逐步提高克唑替尼浓度的方法构建耐药细胞系。约4个月后获得对400nM克唑替尼耐药的Karpas299耐药细胞（Karpas299CR）。2.IGF-1R通路的活化和ALK G1269A突变存在于克唑替尼耐药的细胞。首先对耐药细胞是否存在ALK激酶区域突变进行检测,发现在Karpas299CR细胞中存在ALK G1269A突变,突变丰度为49.79%。这种突变导致ALK和克唑替尼结合能力的下降,从而导致耐药。通过极限稀释的方法,构建Karpas299CR单细胞亚克隆并筛选突变克隆。选择ALK G1269A突变的亚克隆作为后续研究,该细胞命名为Karpas299CRG1269A。检测Karpas299CRG1269A对克唑替尼的敏感性,MTS结果发现Karpas299CRG1269A对克唑替尼耐药。为确定Karpas299CR和Karpas299CRG1269A对克唑替尼的耐药是否由信号旁路的激活所导致,进行蛋白免疫印迹的分析,发现克唑替尼耐药细胞ALK磷酸化水平都较敏感细胞显著上调,同时还出现p-IGF-1R的上调以及下游蛋白STAT和ERK磷酸化水平的增高。3.克唑替尼耐药细胞对比敏感细胞增殖能力增强且出现凋亡抵抗。蛋白免疫印迹技术检测不同浓度克唑替尼处理后的敏感及耐药细胞信号变化,在敏感细胞Karpas299WT中,克唑替尼抑制IGF-1R,STAT3,AKT和ERK的磷酸化,并且随药物浓度增加抑制作用也随之增强;但是在耐药细胞Karpas299CR和Karpas299CRG1269A细胞中,这些信号并没有被抑制。同时,蛋白免疫印迹技术检测敏感及耐药细胞凋亡相关指标PARP,PUMA,Survivin,caspase-3和caspase-9的变化。在敏感细胞Karpas299WT中,促生存蛋白Survivin在克唑替尼处理后明显下调,而促凋亡蛋白PARP、PUMA、caspase-3和caspase-9的裂解带则出现了上调的变化;但在克唑替尼耐药的Karpas299CR和Karpas299CRG1269A细胞中并没有检测到同样的信号变化。流式检测克唑替尼处理后敏感及耐药细胞的凋亡,结果发现,Karpas299WT细胞克唑替尼处理后15–30%的细胞发生了凋亡,但Karpas299CRG1269A耐药细胞则没有出现明显的凋亡变化,Karpas299CR耐药细胞仅在高浓度（800nM）克唑替尼处理时出现了约10%的细胞凋亡。4.IGF-1R抑制剂在Karpas299CR细胞中具有增敏克唑替尼的作用。为明确IGF-1R的激活原因,ELISA检测Karpas299敏感和耐药细胞IGF-1的分泌水平。结果发现,IGF-1在耐药细胞Karpas299CR中出现了较敏感细胞Karpas299WT三倍以上的上调。IGF-1和克唑替尼联合处理部分抵抗克唑替尼对Karpas299WT细胞的抑制。而且,对克唑替尼处理的Karpas299WT细胞应用IGF-1,导致IGF-1R和下游信号AKT和ERK磷酸化水平的增强。同时,敲减IGF-1R联合克唑替尼出现了比单独克唑替尼处理更明显的信号抑制。MTS检测IGF-1R抑制剂联合克唑替尼对耐药细胞增殖的影响,发现两药联合逆转了Karpas299CR细胞对克唑替尼的耐药。蛋白免疫印迹技术检测结果发现,两药联合更好地抑制了ALK,IGF-1R以及下游蛋白STAT3,AKT和ERK的磷酸化。MTS检测IGF-1R抑制剂联合克唑替尼对Karpas299CRG1269A细胞增殖的作用,两药联合并没有比单药应用取得更明显的增殖抑制。蛋白免疫印迹技术检测结果同样发现,两药联合没有使蛋白磷酸化出现比单药处理时更明显的下调。流式检测IGF-1R抑制剂和克唑替尼联用对细胞凋亡的影响,发现Karpas299CR细胞两药联合较单药应用出现了凋亡细胞的增加,而在Karpas299CRG1269A细胞中,细胞凋亡无明显变化。5.二代ALK抑制剂逆转克唑替尼耐药。尽管Karpas299CR和Karpas299CRG1269A细胞对克唑替尼耐药,二代ALK抑制剂仍然有效。MTS检测五种二代ALK抑制剂alectinib,ceritinib,TAE684,ASP3026和AP26113对细胞增殖的影响,结果发现,五种ALK抑制剂均有效抑制克唑替尼耐药细胞的增殖。蛋白免疫印迹技术检测发现当应用二代ALK抑制剂处理克唑替尼耐药细胞时,ALK,STAT3,AKT和ERK的磷酸化水平显著下调。6.ALK/IGF-1R联合抑制Karpas299CR细胞增殖和信号变化。AP26113和certinib是靶向ALK,同时对IGF-1R具有选择性抑制的二代ALK酪氨酸激酶抑制剂。AP26113联合IGF-1R抑制剂在Karpas299CR细胞取得了比单独应用其中一种药物更加明显的抑制,而在Karpas299CRG1269A细胞中,两药联合的抑制并未优于单药的抑制率。Ceritinib联合应用IGF-1R抑制剂也观察到了同样的结果。蛋白免疫印迹技术检测结果发现,Karpas299CR细胞两药联合对IGF-1R,AKT,和ERK的磷酸化造成了较单药更强的抑制,而Karpas299CRG1269A细胞两药联合的信号和单药应用相比无明显变化。结论:1.IGF-1通过活化IGF-1R及下游信号STAT3、AKT和ERK诱导ALK阳性ALCL细胞对克唑替尼的耐药;2.联合应用IGF-1R抑制剂和克唑替尼逆转ALK阳性ALCL细胞对克唑替尼的耐药;3.在ALK阳性ALCL克唑替尼耐药细胞中,ALK G1269A突变同样介导其对克唑替尼的耐药;4.二代ALK抑制剂alectinib,ceritinib,TAE684,ASP3026和AP26113均能有效克服ALK阳性ALCL细胞对克唑替尼的耐药;5.对于IGF-1R活化伴有ALK G1269A突变的ALK阳性ALCL克唑替尼耐药细胞,IGF-1R抑制剂对二代ALK抑制剂ceritinib和AP26113同样具有增敏的作用。