背景炎症反应是机体抵御外源感染和损伤的繁杂的级联过程。炎症是一把双刃剑,适当的炎症在控制感染和组织修复中发挥重要作用,不受控制的炎症不仅损害机体正常的生理功能,而且常常引起多种不同的慢性疾病。炎症被认为是多种疾病的驱动因素,包括感染、动脉粥样硬化、癌症、神经退行性疾病和自身免疫性疾病等,而且炎症与老年性疾病的相关程度非常高。尤其是慢性炎症,是导致年龄相关疾病的主要因素。含锚蛋白重复序列和IBR结构域蛋白1（ANKIB1）含有多种结构域和模体,已有研究表明,其所包含的泛素结合模体以及肿瘤坏死因子相关因子6（TRAF6）结合模体与多种炎症反应相关的信号通路关系密切,预示ANKIB1可能在炎症反应中发挥重要的调节作用,但目前为止关于ANKIB1在炎症反应中的作用和调节机制尚无研究报导。目的1.研究ANKIB1对炎症相关细胞因子表达的影响2.探究ANKIB1调节炎症的作用机制方法1.构建ANKIB1基因敲除的HeLa细胞株构建人ANKIB1基因的CRISPR/Cas9敲除载体,转染至HeLa人宫颈癌细胞中,用嘌呤霉素筛选出稳定转染的细胞,利用梯度稀释法进行细胞亚克隆,PCR结合DNA测序鉴定ANKIB1基因敲除的HeLa细胞株。2.ANKIB1^-/-HeLa细胞的转录组分析培养并收获生长至对数生长期的野生型及ANKIB1^-/-HeLa细胞,委托上海派森诺生物科技股份有限公司进行转录组测序。3.Ankib1^-/-纯合子代小鼠的构建和鉴定Ankib1^+/-杂合C57BL/6小鼠由新乡医学院GRIS实验室构建。以杂合的雌雄小鼠进行合笼交配,从F1代小鼠中筛选出Ankib1^-/-纯合子代小鼠:取3-4w龄F1代小鼠,剪取部分脚趾于离心管中,加入200μL缓冲液GA和20μL蛋白酶K,在56℃条件下消化过夜;使用基因组提取试剂盒提取F1代小鼠基因组DNA,以小鼠基因组为模板进行PCR,根据PCR扩增出目的片段的大小来鉴定子代小鼠的基因型。4.分析ANKIB1对LPS诱发小鼠炎症的影响对获得的Ankib1^-/-纯合子代小鼠进行腹腔注射LPS,以同批次鉴定的野生型小鼠为对照。按照LPS 5mg/kg的使用量,根据小鼠的体重腹腔注射LPS,20h后处死小鼠,然后分别采取各个小鼠的血液、肺泡灌洗液以及心脏、脾脏、肾脏、肝脏等组织器官。最后利用ELISA、qPCR等实验方法分别检测IL-1β、IL-6和TNF-α等炎症细胞因子的表达变化。5.ANKIB1对炎症的调节作用分别提取ANKIB1^-/-HeLa细胞系和Ankib1^-/-小鼠的RNA,利用qPCR技术检测TLR4的表达。在ANKIB1^-/-HeLa细胞系中,分别对细胞转染或共转染pRK5-HA-Ub、pBudCE-Flag-TRAF6和pCMV-Myc-ANKIB1,利用Co-IP的实验方法检测ANKIB1对TRAF6泛素化的影响。结果1.通过与野生型HeLa细胞株基因序列进行比对,最终得到ANKIB1^-/-HeLa细胞株。序列比对结果显示,在ANKIB1^-/-HeLa细胞株中缺失了一段91 bp的核酸序列,具体序列为:TTC CGT AAA GCA CTC ATC AAT GGT GAT GAAAAC CTG GCC TGC CAA ATA TAT GAA AAC AAT CCT CAG CTA AAA GAA TCT CTT GAT CCA AAT A。此序列位于野生型人HeLa株ANKIB1基因的48785-48875处。2.通过与野生型小鼠基因序列进行比对,最终得到Ankib1^-/-小鼠动物模型。序列比对结果显示,在Ankib1^-/-小鼠中缺失了一段62 bp的核酸序列,具体序列为:CTC GCT TAG CAC GGC CTG TGG AAG ATG ATT TCA GAA GGG CAG ATT GTC TGC AGA TGA TCT TA。此序列位于野生型小鼠Ankib1基因的33512-33573处。3.Ankib1^-/-纯合子代小鼠腹腔注射LPS后,与野生型小鼠相比,Ankib1基因敲除后小鼠的IL-1β、IL-6以及TNF-α在蛋白水平和RNA水平的表达明显升高。4.在ANKIB1^-/-HeLa细胞系和Ankib1^-/-纯合小鼠模型中,与野生型的HeLa细胞系和小鼠相比,与LPS相关的TLR4的表达明显升高。5.在ANKIB1^-/-HeLa细胞系中,ANKIB1显著抑制TRAF6的泛素化。结论1.ANKIB1能够抑制炎症细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达2.ANKIB1通过下调TLR4、TRAF6途径来减轻LPS诱导的炎症反应