论文部分内容阅读
目的：树突状细胞(dendritic cell, DC)具有激活免疫应答和诱导免疫耐受的双重功能。其免疫功能与成熟状态密切相关,成熟DC具有很强的抗原提呈功能,激活免疫应答；未成熟DC主要功能为摄取、处理和加工抗原,不能提供共刺激信号,从而诱导免疫耐受。Wnt信号通路被证实是调控免疫细胞生长发育的重要信号通路,能直接影响免疫细胞的生物学功能。本研究从健康人外周血制品(白膜)分离培养出树突状细胞(dendritic cell, DC)并进行形态功能鉴定,探讨不同成熟状态树突状细胞中经典Wnt信号通路相关基因的表达水平。方法：1、细胞培养：从健康人外周血制品(白膜)中通过密度梯度离心和贴壁法分离获得单个核细胞,将细胞接种到25cm2培养瓶37℃,5%CO2贴壁3小时。收集贴壁细胞,应用rhGM-CSF和rhIL-4体外扩增和诱导6天,在第6天加入rhTNF-α刺激促成熟24小时,分别将加入rhTNF-α前后(第5天和第7天)收获的细胞分为未成熟DC组和成熟DC组。2、形态及功能鉴定：应用光镜观察细胞形态,电镜观察细胞超微结构,流式细胞术检测表面标志CDla、HLA-DR、CD83、CD86、CD40、CD80表达水平,同种异体混合淋巴细胞反应检测DC刺激淋巴细胞增殖的能力。3、应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测未成熟DC和成熟DC中GSK-3β和β-catenin的mRNA表达水平并比较其差异。4、应用蛋白免疫印迹(western-blot)检测未成熟DC和成熟DC中GSK-3p和β-catenin蛋白表达水平并比较其差异。结果：1、培养细胞在第3天开始呈半悬浮生长,体积增大,数量增多,表面可见少量毛刺状突起；在第7天呈悬浮生长,表面可见大量毛刺状或树枝状突起,体积未再变大。电镜下细胞形态不规则,表面粗糙,有大量不规则突起,层叠状皱襞明显可见。2、与第5天收获的DC表达的表面标志CDla、HLA-DR、CD83、CD86、CD40、CD80表达水平比较,第7天收获的DC表面表达标志表达水平明显升高。同种异体混合淋巴细胞反应显示第7天DC具有激发淋巴细胞增殖的能力。3、未成熟DC中GSK-3β的mRNA表达水平高于成熟DC,未成熟DC中β-catenin的mRNA表达水平低于成熟DC,有统计学意义(P＜0.05)。4、未成熟DC中GSK-3p蛋白表达水平高于成熟DC,未成熟DC中p-catenin蛋白表达水平低于成熟DC,有统计学意义(P<0.001)。结论：1、从白膜中分离获得PBMC、联合细胞因子rhGM-CSF、rhIL-4和rhTNF-α培养树突细胞的方法,可获得数量较多,纯度较高的DC。2、培养的细胞具有典型的DC的形态特征,在细胞表面标志和功能试验上证实了未成熟DC和成熟DC不同的功能特性。3、未成熟DC和成熟DC中GSK-3β和β-catenin的表达水平的差异与DC成熟状态密切相关,可能参与调控DC成熟。